CRISPR在醫學上的應用
自從作為細菌適應性免疫系統被發現以來,CRISPR-Cas9 已被重新定位為一種強大且革命性的基因編輯工具,提供了對基因序列進行有針對性和精確改變的方法,包括其他 Cas 變體,如 dCas9、Cas12 和Cas13。CRISPR 系統的靈活性、簡單性和效率使其在眾多應用中得到快速發展——尤其是在醫學領域。除了用於基因治療的基於 CRISPR 的療法外,CRISPR 還被用於創建相關疾病模型、識別緻病基因、用於高通量篩選,甚至用作診斷工具。本文著眼於 CRISPR 在醫學中的應用,並重點介紹了最近利用 CRISPR 改善人類健康的工作。
使用 CRISPR 創建準確的疾病模型
為了理解和闡明支持和導致疾病的生物過程,以及識別和測試潛在的治療方案,相關且適當的模型系統至關重要。CRISPR在體外和體內在無數不同細胞類型中的靈活性和效率允許快速生成細胞和轉基因動物模型,允許創建穩健和復雜的疾病模型,包括 iPSC、類器官、和精確的癌症模型。例如,Heckl 等人。通過利用 CRISPR 的多重執行能力並同時敲除多個基因,創建了白血病模型。1個CRISPR 還被用於創建阿爾茨海默病的準確模型,這在動物身上很難建模。使用 iPSC,CRISPR 被用於創建顯示阿爾茨海默病表型的 iPSC 神經元以及糾正疾病相關突變的同基因細胞對。2個
使用 CRISPR 進行高通量篩選
除了革新基因編輯之外,CRISPR 現在是基因組篩選的強大工具,有助於對一系列細胞類型中的基因功能進行公正的詢問,揭示以前未知的分子機制。使用 CRISPR-Cas9 的混合文庫篩選涉及將各種遺傳擾動引入細胞庫——那些賦予生物挑戰抗性或敏感性的基因隨後通過對混合細胞進行大規模並行測序來識別。或者,可以使用 CRISPR 進行陣列篩選,從而使用更複雜的表型分析。擴展的 CRISPR 工具包意味著除了基因敲除外,篩選還可以包括基因激活和沈默——此外還有單細胞 RNA 測序和空間成像等高內涵讀數。3個
除了識別基因、通路和分子機制以了解導致疾病的生物過程外,基於 CRISPR 的基因篩選還可以識別藥物靶標並確定其優先級。PICKLES v3 是一個更新的匯集體外CRISPR 基因敲除文庫必要性篩選的數據庫,它允許可視化許多不同細胞系和腫瘤類型的基因必要性和適應性分數。4個
基於 CRISPR 的診斷
成功干預疾病治療以及流行病學監測需要準確及時地檢測疾病。核酸檢測是一種靈敏且特異性的診斷方法,但成本高且需要受過訓練的人員。CRISPR 的使用是分子傳感領域令人興奮的發展。在短短幾年內,基於 CRISPR 的診斷已經從實驗工具發展為靈敏、快速、經濟且便攜的臨床相關診斷技術,使檢測能夠在護理點甚至家中進行。
第一種基於 CRISPR 的診斷方法,例如 NASBACC(基於核酸序列的擴增-CRISPR 切割),使用 Cas9 檢測低飛摩爾範圍內用於檢測寨卡病毒的雙鏈 DNA。5或者,SHERLOCK(特異性高靈敏度酶報告基因解鎖)和更新的 SHERLOCKv2 利用 Cas13 變體來檢測單個 DNA 或 RNA 分子,從而可以識別來自登革熱、寨卡病毒和肺炎病原體的 ssRNA。6,7更新後的 SHERLOCKv2 還允許在 zeptomolar 範圍內對核酸進行多重檢測 (10 -21M) 通過紙條上抗體偶聯的金納米粒子檢測裂解的報告分子。陳等。還使用 Cas12a 變體開發了 DETECTR(DNA 核酸內切酶靶向 CRISPR 反式報告基因),以高精度區分 HPV16 和 HPV18。8個
除了病原體監測,基於 CRISPR 的診斷還可用於疾病監測,包括非小細胞肺癌、結直腸癌、腺癌患者的液體活檢樣本、宮頸癌和生殖系統。9最近,Jiang 等人。使用 CRISPR-Cas13a 系統開發了一種超靈敏的光電化學生物傳感器,用於特異性檢測 miRNA-21,miRNA-21 是一種參與許多生物和疾病過程的小調節 RNA,例如發育、炎症、心血管疾病和癌症。10
用 CRISPR 抗癌
CRISPR 糾正、破壞或替換突變基因序列的能力具有治療人類疾病的潛力。目前正在進行多種疾病的試驗,包括杜氏肌營養不良症、鐮狀細胞病、β 地中海貧血、遺傳性血管性水腫、萊伯先天性黑蒙、艾滋病毒、糖尿病以及癌症。11 2022 年 5 月,一名 T 細胞急性淋巴細胞白血病患者使用健康的供體來源的 T 細胞成功治療,這些 T 細胞經過鹼基編輯以提高其抗癌能力。12
鹼基編輯是一種利用 Cas9 機制傳遞鹼基編輯器以引發單點突變的方法,因此可以提高患者的安全性,因為它不依賴於雙鏈斷裂的引入。陳等。也在研究用於癌症治療的 CRISPR,但正在使用基因編輯將癌細胞重新用於治療性腫瘤細胞 (ThTC)。使用 CRISPR,使腫瘤細胞對乾擾素-β 具有抗性,並進行改造以釋放免疫調節劑,包括 IFN-β 和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)。然後,ThTC 能夠消除小鼠的膠質母細胞瘤腫瘤,從而提高存活率和對癌症的長期免疫力。13
CRISPR的治療優勢
CRISPR 技術徹底改變了基因編輯,並為人類健康開闢了許多有前途的應用。除了闡明驅動疾病的生物學機制外,CRISPR 還有助於治療劑的鑑定和測試,甚至可以高靈敏度地檢測病毒、細菌和人類核酸。CRISPR 不斷發展,工作重點是提高系統的效率和精度,包括開發 prime 編輯,它可以在沒有雙鏈斷裂或供體 DNA 模板的情況下誘導基因序列的靶向改變——一個可以提供更高安全性的系統用於人類基因治療。14使用 CRISPR 進行表觀基因組編輯還可以為多種疾病提供新的治療選擇,包括代謝性疾病、癌症、血液疾病和中樞神經系統疾病。15
CRISPR基因編輯系統
- 使用 CRISPR-Cas9 進行基因組編輯本質上很簡單,只需要一個 sgRNA 來靶向 Cas9 核酸內切酶,它在目標位點引入雙鏈斷裂 (DSB),激活 NHEJ(非同源末端連接)通路,這將引入一個移碼突變和敲除目標基因
- 或者,在存在外源 DNA 模板的情況下,同源重組途徑將導致功能突變的獲得
- 擴展的 CRISPR 工具包意味著除了基因敲除和敲入外,還可以使用 CRISPRi 和 CRISPRa 調節基因表達
- CRISPR-Cas9 是使用最廣泛的系統——儘管 Cas12 和 Cas13 等替代變體已用於滿足不同的 PAM 要求或用於靶向 RNA