質譜細胞術與流式細胞術
質量細胞術於 2009 年首次推出,是流式細胞術的進步,旨在分析每個樣品的更多參數。在這裡,我們了解質譜流式細胞術和熒光流式細胞術的不同之處,並為方法選擇提供指導。
根本差異
質譜細胞術和流式細胞術都基於使用標記抗體進行多重單細胞分析的概念。然而,這兩種技術之間存在一些根本差異。“質譜流式細胞術,也稱為飛行時間流式細胞術(CyTOF ®Standard BioTools 流式細胞術和成像營銷總監 Marla Lubinsky 解釋說:“相比之下,流式細胞術依靠熒光團標記的抗體來檢測細胞靶標。這種標記的變化使得質譜流式細胞術能夠同時檢測同一樣本中的 50 個或更多標記,而流式細胞術則受到可以在沒有過度重疊或自發熒光的情況下區分的顏色數量的限制。”
目前,典型的流式細胞術實驗將檢測大約 8-10 個不同的標記,儘管研究人員構建更大的面板變得越來越容易。BioLegend 細胞分析產品經理 Kenta Yamamoto 表示:“隨著光譜流式細胞術的出現 和高維流式細胞術的優化,單個實驗中可測量的參數數量不斷增加。” 為了說明這一點,他重點介紹了最近發表的兩篇出版物,描述了48 色質量細胞計數面板 和43 色流式細胞計數面板的開發,並表明這兩種技術之間的差距正在縮小。
除了使用的標記類型之外,採集方法代表了質譜流式細胞術和流式細胞術之間的另一個區別。“在質譜流式分析過程中,細胞被原子化和電離,然後通過飛行時間質譜分析金屬標籤,”CellCarta 細胞計數和 CyTOF 副總監 Scott Weiss 說道。“流式細胞術採集涉及通過多個激光器運行完整的熒光標記細胞並通過檢測器捕獲發射的光。實際上,雖然由於細胞通量較低,質譜流式分析儀的採集時間較長,但可以使用更高的參數面板和條形碼技術來增強這一點。”
優點和當前限制
到目前為止,我們已經確定,與流式細胞術相比,質譜流式細胞術具有能夠檢測每個樣本更多標記的優勢,而流式細胞術具有更快的採集時間並保持細胞完整,這意味著它們可以被檢索以供進一步使用。但這兩種技術各有一些其他優點和局限性。
“由於質量細胞儀僅採用一個檢測器,因此無需為每個實驗進行特殊的調諧或校準,”盧賓斯基說。“此外,可以從單管進行同步分析,無需單染色或自發熒光對照,這在小鼠和臨床研究樣本供應短缺的情況下具有重要優勢。例如,使用Standard BioTools™ Maxpar® Direct™ Immune Profiling Assay™(一種經過驗證的干式抗體組合,用於 CyTOF XT™ 和 Helios™ 質譜流式細胞術系統),研究人員可以從僅 300 µL 的樣品中分析 30 種免疫標記物。血液,無需使用額外的樣本進行染色對照。”
質譜流式細胞儀的另一個優點是金屬標籤極其穩定,可以承受固定/透化和冷凍,在處理樣品時信號不會發生任何變化。這使得同時對細胞表面和細胞內標記物進行染色成為可能,並允許存儲標記的樣品並隨後運輸以進行多位點分析。另一方面,熒光團不能抵抗磷酸化標記或細胞內和功能靶標所需的嚴酷工作流程。
另一方面,質量細胞術目前的局限性與流式細胞術相比它是一種相對較新的技術有關。“在商業上,重金屬偶聯抗體在供應商中的應用不如熒光團偶聯抗體廣泛,”Yamamoto 說。“因此,如果需要大規模細胞計數板,研究人員的很大一部分時間可能會專門用於自我試劑的製備,例如在內部進行抗體綴合。” 為了簡化這一過程,BioLegend 開發了 Maxpar® Ready純化抗體,這些抗體經過優化,可與 Standard BioTools 的 Maxpar ®抗體標記試劑盒一起使用。
質譜流式細胞儀還處於起步階段,這也意味著習慣使用熒光流式細胞儀的研究人員可能需要接受額外的培訓才能操作新儀器。Weiss 指出:“目前,流式細胞術仍然是少於 18 種顏色的較小面板的首選,而當需要超過 20 個標記時,往往會採用質量細胞術。” “但是,隨著這兩種技術不斷突破單個樣本測量的極限,偏好可能會隨著時間的推移而改變”。
選擇哪種技術
在選擇質譜流式細胞術和流式細胞術時,Weiss 建議研究人員首先明確他們需要檢測多少標記。“如果標記的數量低於 25 個,流式細胞術很可能更容易部署,”他說。“如果如上所述,儘管光譜流式細胞術正在迅速成為一種替代選擇,但質譜細胞術對於復雜的面板來說是經過更多測試和更真實的平台。” Yamamoto 對此表示同意,並評論說,對於大多數潛在用戶來說,流式細胞術因其高通量、用戶友好性以及跨機構的儀器可用性而受到青睞。
盧賓斯基警告不要讓熒光通過有偏見的研究設計來限制您的研究問題。“根據你現有的標記,只關注你認為可能重要的內容,而不是樣本中的所有內容,你的研究可能會出現偏差,”她說。“這種方法可能會導致細胞群缺失或意想不到的相互作用,並且可能意味著新的信號事件或對某種細胞類型的顯著影響被忽視。CyTOF 使研究人員能夠構建更大的面板,不僅提供感興趣的細胞群的粒度,還提供一個管中的異常值。這種以粒度捕獲不同細胞群的獨特能力意味著 CyTOF 可以常規捕獲未包含在較低參數熒光面板中的目標,”她補充道。
通過質譜流式細胞術,您可以更輕鬆地量化免疫系統的廣度和深度,而流式細胞術通常更適合更基礎且標記物數量更少的實驗。
實驗設計技巧
無論您選擇走哪條路線,您都可以採取幾個步驟來確保結果可靠。“由於質譜流式細胞術和流式細胞術都遵循非常相似的染色方案,因此許多最佳實踐適用於這兩種技術,”Yamamoto 說。“例如,在準備單細胞懸浮液時,採取措施保護目標表位非常重要。而且,對於細胞染色,使用經過驗證的高親和力抗體是關鍵。您還需要了解模型系統的生物學特性,包括細胞識別所需的標記以及這些標記的表達量。”
在流式細胞儀面板設計方面,研究人員可以使用各種在線工具,包括Biocompare 的流式細胞儀面板生成器。Lubinsky 表示,對於質譜流式分析,經過驗證的 Maxpar 直接免疫分析測定是一個很好的起點。“研究人員還可以通過從 20 多個現成的面板和超過 800 種抗體的目錄中進行選擇來捕獲其他感興趣的標記,”她說。並考慮對樣本進行條形碼編碼,這是減少技術變化的關鍵,也是使用 CyTOF 技術時的一個簡單步驟。
文章作者-Emma Easthope
Emma Easthope 是英國 Cambridge Technical Content Ltd 的創始人兼董事。自 2000 年從坎特伯雷肯特大學獲得生物學學士學位以來,她在 Millennium Pharmaceuticals、阿斯利康和 Cellzome。她現在製作了廣泛的科學內容,包括 Biocompare 的常規專題。