通過多參數流式細胞術獲得可靠的結果
使用多參數流式細胞術,研究人員現在可以檢測多達 40 種不同的標記物。在這裡,我們探討了一些使這成為可能的技術進步,並分享了獲得可靠結果的技巧。
面板大小取決於您的研究目的
Bio-Rad 全球產品經理 Mike Blundell 博士表示,流式細胞儀面板的平均大小已從五年前的約 4-6 plex 增長到如今的 8-10 plex。但是,雖然現在可以檢測到比以前更多的標記,但面板大小最終取決於您想要回答的生物學問題。“如果你用 GFP 等熒光蛋白轉染了細胞,那麼確定陽性百分比通常就足夠了,因此一個標記就足夠了,”他說。“然而,如果你想研究對藥物治療、細胞療法或疫苗的總體免疫反應,則需要多種標記物來檢測所有相關的細胞類型並得出合理的結論。”
Cytek 美國應用技術負責人 Patrick C. Duncker 博士補充道,雖然高度集中、假設驅動的科學問題可能只需要 8-14 個標記即可充分探究,但更廣泛的、產生假設的免疫表型實驗可能需要使用更多的標記。“過去三年發布的優化多色免疫熒光面板 (OMIP) 非常清楚地展示了這兩種範式,其中 23 個面板中有 7 個專注於使用少於 14 個標記的特定細胞子集,其他主要是使用多達 40 個標記的免疫表型面板如OMIP-069中所示。較小的聚焦面板總會有一席之地,就像總會有人突破單管分析的極限一樣。在這兩個類別中,我們看到了流式細胞儀面板中更多標記和更多顏色的總體趨勢。”
推動實驗複雜性增加的關鍵因素
那麼,面板尺寸向上變化的背後是什麼?安捷倫科技公司高級產品經理 Garret Guenther 博士表示,流式細胞儀的改進發揮了重要作用。“開發具有更多激光器和更多檢測通道的流式細胞儀,例如可配備多達 5 個激光器和多達 30 個熒光檢測通道的NovoCyte Penteon ,對於增加可檢測的標記物數量至關重要。同時測量,”他報告道。“此外,簡化補償和實驗設置的能力促進了這些更先進儀器的採用,並有助於提高用戶之間和不同實驗室之間的可重複性。”
值得注意的是,全譜流式細胞術的出現使得構建更大的面板變得更加容易。“通過利用每種熒光染料發出的整個光譜,而不是離散的波長范圍,光譜流式細胞儀允許研究人員分析每個樣品的 40 多個標記,”鄧克解釋道。“Cytek ® Aurora和Northern Lights ™ 系統不僅在熒光染料選擇方面提供了更大的靈活性,還簡化了小型面板的面板設計流程(3 激光系統上最多 15 個標記,5 激光系統上最多 25 個標記),但它們也刺激了新型熒光染料的開發,例如 Cytek 的 cFluor ®試劑。例如,cFluor®YG584 和 PE 在傳統流式細胞儀上無法區分,但它們可以在 Cytek 全光譜系統上組合使用,為研究人員在構建更大的流式細胞儀面板時提供了另一種熒光染料選擇。”
Blundell 呼應 Duncker 的觀點,即儀器和試劑的改進正在推動構建更大面板的趨勢,Blundell 指出 Bio-Rad 的 StarBright 染料開髮用於解決常見的流式細胞術問題,並為研究人員提供更多熒光染料可供選擇。“StarBright 染料可通過 355 nm、405 nm、488 nm 和 561 nm 激光激發,”他說。“它們的特點是亮度高,可以增加研究人員檢測稀有/低抗原密度群體的機會,並且具有窄激發和發射曲線,以最大限度地減少溢出。StarBright 染料也比許多舊的熒光染料更容易使用。由於它們不需要特殊的緩衝液或染色方案,因此很容易集成到現有的面板中。由於它們可以預混合超過 30 天,因此可以使用同一種混合物對多個樣品進行染色,從而節省時間並減少錯誤。”
成功進行多參數流式細胞術的五個技巧
了解您選擇的模型系統的生物學特性,包括抗原密度、共表達和實驗條件等因素
檢查您的流式細胞儀的功能
考慮列出商業抗體偶聯物列表,以闡明可用於面板設計的選項
嚴格實驗優化,包括細胞製備方法和染色方案
考慮如何分析數據,並記住包括適當的控制
簡化實驗設計
設計多參數流式細胞術實驗應該是一個有條理且數據驅動的過程。Blundell 建議您首先確定檢測感興趣的細胞類型所需的標記。“需要考慮的因素包括明確鑑定所需的標記數量、抗原密度、標記在細胞上(或細胞內)表達的位置,以及是否需要某種形式的治療來刺激標記表達,”他說。
同時,您還需要考慮流式細胞儀的功能。“具體來說,如果您使用傳統的流式細胞儀,您將需要檢查您的儀器配備了哪些激光器和檢測通道,因為這將決定您能夠使用哪些熒光染料以及您可以在同一台儀器中分析的最大參數數量。實驗,”岡瑟說。對於光譜流式細胞術,只要熒光染料被激光激發,它就會兼容。
接下來,您應該將熒光染料分配給不同的標記。“為您感興趣的抗體建立可用熒光染料列表可以節省時間,”鄧克建議。“通常,不太常用的標記物的商業熒光染料選項較少,因此在構建面板的其餘部分之前,首先將熒光染料分配給這些標記物是謹慎的做法。” Guenther 還建議策略性地選擇熒光染料以與抗原豐度保持一致。“如果細胞上的抗原豐度較低,最好將其與非常明亮的熒光染料配對,反之亦然,”他說。
此後,優化實驗條件至關重要,包括細胞製備方法和染色方案。這應包括確定合適的細胞濃度,採取措施避免細胞死亡或聚集,並確定是否需要順序染色以防止細胞外表位因固定和透化而受損。
最後,您必須決定如何分析數據,以充分利用來之不易的結果。“這裡的選擇包括是否使用雙色圖執行串行門控,或者是否使用無監督聚類算法,”布倫德爾說。“如果有疑問,流式細胞儀和試劑的製造商通常可以提供指導並分享相關資源和出版物的鏈接。”
文章作者-Emma Easthope
Emma Easthope 是英國 Cambridge Technical Content Ltd 的創始人兼董事。自 2000 年從坎特伯雷肯特大學獲得生物學學士學位以來,她在 Millennium Pharmaceuticals、阿斯利康和 Cellzome。她現在製作了廣泛的科學內容,包括 Biocompare 的常規專題。