臨床樣本中的蛋白質定量
細胞群生物學狀態的變化會導致疾病表型。每個細胞都會產生介導這些表型的蛋白質。“在遺傳學的中心法則中,蛋白質代表實時生物學,因為它們是健康和疾病的動態和可操作目標,”Olink Proteomics 全球產品經理 Katarina Hornaeus 解釋道。“此外,隨著細胞對外部刺激做出反應,蛋白質代表了環境和生活方式因素對細胞表型的影響。” 因此,蛋白質豐度和行為的改變可以幫助臨床醫生診斷疾病並確保及時治療。
由於蛋白質在細胞的生物學狀態中起著重要作用,因此它們成為生物標誌物,隨時可以作為藥物開發的靶標被發現。1識別不同疾病狀態的生物標誌物,再加上對疾病機制的更深入了解,可以“幫助為患者提供早期疾病狀態的正確治療並改善臨床結果,”Hornaeus 補充道。因此,測量蛋白質豐度代表了人類疾病研究和診斷的一個重要方面。作為回應,已經開發了許多識別和量化蛋白質的方法,每一種方法都用於識別和驗證新的疾病生物標誌物。
用於蛋白質定量的質譜法 (MS)
MS 是表徵蛋白質一級結構的基本工具。它依靠測量電離分子的質荷比 (m/z) 來闡明蛋白質的肽序列。2對現有 MS 管道的修改增強了其檢測蛋白質結構變化的能力。一方面,電噴霧電離 (ESI-MS) 3和自上而下質譜 (TD-MS) 4允許天然蛋白質在質譜儀中電離時得以保留。這不僅可以表徵蛋白質豐度,還可以表徵具有特定翻譯後修飾的蛋白質種類的豐度,從而為細胞的表型增加另一層。5個
其他 MS 修改可實現準確的蛋白質定量。在細胞培養物中氨基酸穩定同位素標記 (SILAC) 中,兩個細胞群被輕同位素或重同位素標記,以產生輕氨基酸和重氨基酸。6這種方法可以使用內部標准進行絕對量化,但這些檢測只能通過體外細胞培養來實施。7用於相對和絕對定量的同位素標籤 (iTRAQ) 可以用肽和蛋白質中的單一同位素種類標記伯胺的 N 末端和側鏈。8然後使用裂解後產生的報告離子來量化蛋白質豐度。9
儘管 MS 協議取得了進展,但 Hornaeus 指出其在蛋白質定量方面的局限性。“雖然質譜法非常適合在細胞和組織裂解物中發現蛋白質,但需要大量的樣品製備來檢測血漿、血清或腦脊液 (CSF) 等複雜臨床標本中的低豐度蛋白質。這可能會在研究中引入方差和偏差,使蛋白質量化工作複雜化。此外,質譜儀需要大量空間和維護,降低了蛋白質定量的可擴展性,”她指出。
基於抗體的蛋白質定量——多重免疫測定
免疫測定使用通過監測特定於這些靶標的抗體的結合來量化靶分子的抗體。第一次免疫測定通過酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 測量了與檢測抗體結合的報告酶的活性。10然而,ELISA 每次反應只能檢測一種分析物,降低了評估蛋白質作為疾病生物標誌物的可擴展性。多重免疫測定使用不同的、顏色編碼的珠子來解決這個問題,這些珠子捕獲溶液中的不同分析物並使用熒光染料進行檢測。這允許在單個反應孔內同時量化多種蛋白質,以提高可擴展性並降低試劑成本。此類測定已用於量化生長因子、營養因子和其他在幹細胞通訊、存活、增殖、分化和死亡中發揮作用的蛋白質。11
不管免疫測定的種類如何,都可能發生與抗體的交叉反應。抗體可以與靶蛋白以外的分子結合,從而對準確性和重現性產生不利影響。“面板的 plex 等級或組成也會影響通過多重免疫測定進行的量化。此外,引入抗體後的清洗步驟會增加丟失相關信息的風險,”Hornaeus 指出。為了解決這些缺點,Olink Proteomics 開發了鄰近延伸分析 (PEA)。PEA 不是使用單一抗體,而是使用兩個匹配的抗體,每個抗體都與一個 DNA 編碼的寡核苷酸標籤相連,這些標籤可以相互雜交。雜交後,DNA 條形碼序列可以通過定量 PCR (qPCR) 或下一代測序 (NGS) 進行擴增和量化。
PEA 管道提高了特異性和靈敏度,引入了以高通量速率量化低豐度蛋白質的能力。Hornaeus 將 PEA 的靈敏度提高歸因於“無需樣品預處理、PCR 預擴增以及使用 qPCR 和基於 NGS 的技術來量化蛋白質豐度的工作流程。” 為了支持這一點,PEA 通過測量具有寬動態範圍和低至 pg/mL 水平的靈敏度的 728 种血漿蛋白來補充基於 MS 的方法。12這種方法還用於識別 11 種蛋白質特徵,這些特徵在診斷時可區分宮頸癌患者。13
借助自動化樣品製備,PEA 還可以在單次運行中量化 96 個樣品中的近 3000 種蛋白質。Hornaeus 將其 Flex 產品的靈活性歸因於以下內容:“我們的 Flex 產品包含一個包含大約 200 種預先驗證的蛋白質生物標誌物檢測的庫,客戶可以從中自由混合和匹配其中的 15-21 種,以構建他們自己的 Flex 面板。每項驗證都包括對靈敏度、特異性、精度、線性和生物範圍的控制。”
結論
生物醫學研究已經演變為深入研究疾病分子機制的願望。蛋白質是這些機制的關鍵介質之一,驅動細胞表型並決定健康和疾病狀態。已經開發了許多蛋白質定量方法以進一步研究蛋白質在疾病中的作用。基於 MS 的方法有助於識別新蛋白質,但難以實現高通量和絕對定量。多重免疫測定解決了可擴展性問題,但交叉反應會降低蛋白質定量的準確性。Olink Proteomics 開發的 PEA 技術解決了這兩個問題,能夠在廣泛的檢測範圍內對蛋白質進行定量,並實現高靈敏度和特異性,隨著 Olink Flex 等技術的出現。
文章作者-Paul Naphtali
Paul Naphtali 擁有理學碩士學位。在麥克馬斯特大學獲得生物學博士學位,他的研究重點是使用下一代測序技術追踪地下水糞便污染。他還獲得了博士學位。麥克馬斯特大學生物化學和生物醫學科學專業,他的論文研究重點是使用生物信息學工具進行基因組註釋、轉錄組學和基於分子的分析來研究囊性纖維化氣道感染。