生物標誌物發現的質譜分析:優點和缺點
生物醫學領域目前正遭受可重複性危機的困擾。令人震驚的是,據估計超過 50% 的研究結果無法複製。由於抗體通常表現出非特異性結合,並且可能會經歷批次間的差異,因此有人認為基於抗體的方法可能會導致這種再現性危機。
使用質譜法進行生物標誌物鑑定的優點之一是其高精度和特異性。然而,質譜分析往往比許多涉及抗體的高通量方法慢。Biocompare 最近採訪了四家公司(RayBiotech、Sapient、Thermo Fisher Scientific 和 Waters Corporation)的專家,探討了質譜法用於生物標誌物研究的優點和缺點。
從發現到驗證
生物標誌物必須首先被發現,然後進行驗證,然後才能用於臨床試驗。發現過程(通常採用質譜法或大規模多重抗體檢測)涉及對少量樣品中數千種標記物進行初步篩選。正如 RayBiotech 業務開發副總監賈拉德·威爾遜 (Jarad Wilson) 描述的發現過程一樣,“你扔了足夠多的濕意大利面,希望能粘上一些東西。”
與發現相反,驗證涉及在大量樣本中分析較小的已識別標記子集(通常為一到十個)。Sapient 創始人兼首席執行官 Mo Jain 博士解釋說,驗證大致可以分為兩個階段:技術驗證和生物學驗證。
技術驗證涉及使用替代生物分析技術(通常稱為正交方法)來確認測量結果。例如,如果您使用質譜法進行發現,則可以使用多重陣列、蛋白質印跡、免疫組織化學或單靶點 ELISA 進行後續驗證。
在更廣泛的層面上,生物驗證對於評估您感興趣的生物標誌物在不同個體和不同人群中的表現是必要的。生物學驗證過程通常需要數百到數千個樣本。最終的目標是確保只識別出最俱生物學相關性的生物標誌物,從而最大限度地減少錯誤發現。
為什麼要使用質譜來發現生物標誌物?
Thermo Fisher Scientific 高級營銷經理 Santosh Renuse 博士強調,質譜用於蛋白質生物標誌物發現的主要優勢之一是其高精度和特異性。Renuse 指出,質譜分析的缺點是在血清和血漿樣品中容易出現動態範圍問題。畢竟,不同蛋白質的濃度往往相差十多個數量級。
質譜分析也往往比許多基於多重抗體的方法慢一些。儘管如此,吞吐量隨著時間的推移一直在增加。Renuse 指出,在單次實驗中,質譜法現在足夠靈敏,可以在一小時內檢測細胞和組織中的 7,000 多種蛋白質。這構成了表達蛋白質組的一半以上。
最後,質譜儀可能很昂貴並且難以正確操作。Wilson 指出,RayBiotech 已成功使用其多重夾心抗體陣列開發了 1600 多種人類生物標誌物的定量檢測方法,目前正在評估是否納入質譜分析。“過去幾年,較新的質譜系統變得越來越小,價格也有所下降,但安裝此系統的前期成本肯定很高,”他指出。
通過質譜發現
Renuse 重點介紹了發現過程中涉及質譜分析的幾種技術。例如,常見的基於標記的定量方法包括細胞培養物中氨基酸的穩定同位素標記 (SILAC) 和串聯質量標籤 (TMT)。
無標記方法也經常用於生物標誌物發現研究中的定量。這些方法包括無標記定量 (LFQ) 和數據獨立採集 (DIA)。特別是,LFQ 在生物標誌物發現研究中變得越來越流行,因為它價格低廉並且允許對大樣本進行比較分析。然而,LFQ 也往往不如許多基於標籤的方法準確。
生物標誌物研究質譜的最先進進展
Jain 強調,Sapient 專注於使用快速液相色譜-質譜 (rLC-MS) 技術發現小分子生物標誌物(而不是較大的蛋白質)。他解釋說,“我們開發這些技術是為了對不同的生物樣本進行高通量、非靶向發現篩選”,並指出循環小分子化學揭示了疾病的非遺傳景觀。
使用 rLC-MS 進行探索,Sapient 可以測量每個生物樣品超過 11,000 個小分子生物標誌物。Sapient 的分析捕獲了廣泛化學中的已知和未知分子,範圍從極極性分子到極非極性分子。
“由於我們的方法是非針對性的,我們捕獲的絕大多數生物標誌物都是未知的,這意味著它們從未被測量或結構闡明,”Jain 指出。rLC-MS 方法使用離子遷移譜 (IMS) 對數千種未知標記物進行化學指紋分析。更具體地說,Sapient 使用保留時間、精確質量和碰撞截面 (CSS) 來識別和分類每個未知分子。
Waters Corporation 耗材和實驗室自動化首席產品經理 Joseph Fredette 同意 Jain 的觀點,即 IMS 在生物標誌物發現中發揮著關鍵作用。Fredette 重點介紹了沃特世的 SELECT SERIES Cyclic IMS 飛行時間質譜儀,該質譜儀利用新型循環離子淌度根據生物分子的大小和重量(質荷比)以及形狀來分離生物分子。正如他解釋的那樣,“可以使用像這樣的 IMS 儀器來分離折疊方式不同且形狀不同的異構蛋白變體,而且這種附加的分離能力非常強大。”
未來
生物標誌物的臨床試驗獲得藥物批准的可能性高出兩到十倍。此外,憑藉其高靈敏度,質譜法可能有可能克服與基於抗體的方法相關的一些重現性問題。雖然質譜分析往往比許多基於抗體的方法慢,但通量正在迅速提高。Jain 總結道:“現在我們已經開始放開剎車以提高速度,我認為我們才剛剛開始利用質譜法實際可以做的一切。”
文章作者-Tiffany Yesavage
蒂芙尼是來自科羅拉多州丹佛市的自由醫學作家。