結合紫外-可見光譜和熒光光譜以獲得最佳結果
光譜技術在生物樣品的製備和評估中發揮著重要作用。紫外-可見光譜和熒光光譜是兩種常用的技術,在不同的應用中各有各的優勢。但是,雖然這些方法可以單獨成功使用,但兩種技術的結合可以提供更深入的見解。那麼下次,與其選擇一種技術或另一種技術,為什麼不選擇兩者呢?
紫外可見分光光度計
紫外-可見 (UV-Vis) 光譜法依賴於測量吸收的紫外光或可見光波長並與參考樣品或空白進行比較。對於許多實驗室來說,該技術的關鍵優勢在於其成本、速度和可訪問性。正如 DeNovix 市場開發經理 Andrew Jones 所解釋的那樣,紫外-可見分光光度法“直接測量分析物,因此無需購買檢測試劑或設置標準曲線,因此該方法快速有效,每個樣品的成本為零” ”。瓊斯表示,再加上該儀器易於使用,並且在許多實驗室中都很常見,這意味著“吸光度通常是大多數樣品定量的首選方法”。
另一個主要優點是該技術是非破壞性的。安捷倫科技公司分子光譜學生物製藥營銷總監 Ursula Tems 表示:“在許多情況下,生物應用需要使用小批量、難以獲得或昂貴的核酸、蛋白質或樣品。”允許樣品重複使用或進入下游處理是一個關鍵的好處。
這些優勢意味著 UV-Vis 的兩個廣泛應用是在細菌培養中進行常規光密度 (OD) 測量,以及快速確定 DNA 和 RNA 純度,這兩者對於下游實驗的成功至關重要。“DNA 樣品中提取過程中殘留的污染物(例如鹽、苯酚或蛋白質)的存在可能會干擾下游處理,因此輕鬆識別這些污染物可以節省研究人員因實驗失敗而導致的時間和費用。”
熒光
相比之下,熒光光譜法通過兩種方法之一進行工作。它可以利用許多生物分子(例如蛋白質和核酸)的固有熒光來測量其發射度,或者作為間接測量 – 測量與您感興趣的分析物結合的熒光團發出的熒光。
雖然該技術可能昂貴且耗時,但其優點在於其敏感性和特異性。“當分析混合物的紫外-可見吸收光譜時,混合物中吸收光的所有分子都會對觀察到的吸光度做出貢獻。對於熒光光譜,通常可以使用特定分子的激發波長,以便觀察到該分子特定的發射曲線,”Tems 解釋道。這使得該技術成為混合物中分子特異性定量的首選方法。
該技術的靈敏度還意味著它在較低濃度的樣品或樣品稀缺時更適合使用。熒光的高消光係數使其能夠檢測濃度遠低於紫外-可見光的分子,這意味著需要更少的初始樣品。因此,如果您的濃度較低或供應不足,承擔熒光光譜的額外成本可能是您的最佳選擇。
使用熒光也是檢查分子如何相互作用的流行選擇。熒光光譜的變體包括偏振和熒光共振能量轉移 (FRET) 測定,分別經常用於寡聚和高通量藥物發現篩選研究。
兩者都使用,而不是非此即彼!
由於紫外-可見光譜和熒光光譜各有其各自的優點,因此很容易單獨使用一種技術。然而,正如瓊斯總結的那樣,“吸光度和熒光應該被視為互補的方法,可以結合起來實現全面的樣品質量控制。” 簡而言之,使用這兩種技術可以讓您兩全其美。它允許您結合各自的優勢來創建完整的分析包,確保特定且靈敏的定量以及有關潛在污染物的信息。
雖然這些技術可以同時使用,但在同一工作流程的不同階段使用時,它們具有獨特的優勢。正如島津科學儀器公司分子光譜產品經理 Gilbert Vial 所解釋的那樣,“在進行熒光光譜分析之前,通常會使用紫外-可見光來識別熒光分子的最強波長”。“同時使用這兩種技術[可以幫助]防止研究人員做出錯誤的假設。”
由於紫外-可見分光光度計和熒光分光光度計的優點,實驗室中經常同時使用它們。為了確保獲得最佳效果,Vial 提供了一些成功地將兩者結合使用的技巧。“紫外-可見分光光度法和熒光光譜法相似,並且通常使用相似的附件,”Vial 解釋道,因此請確保“每種技術使用正確的附件,因為它們並不總是可以互換的。” 需要特別注意的一個區域是比色皿——“熒光比色皿的四個側面均未磨砂,以防止任何樣品干擾,而紫外-可見比色皿的兩個側面通常都磨砂。如果在熒光儀器中使用紫外-可見比色皿,磨砂面會濾掉一些到達熒光檢測器的光”並影響您的結果。
同時使用紫外-可見光譜和熒光光譜的好處是顯而易見的,現在許多公司都認識到這一點。雖然在過去,使用這兩種技術可能意味著使用兩台儀器,但新的儀器正在設計中以結合這兩種技術,允許用戶測量紫外-可見光吸光度和熒光,甚至無需更換機器。因此,當使用這兩種技術時,您可以獲得更深入的洞察力,並且現在可用的組合儀器更加方便,為什麼不同時使用這兩種技術呢?
文章作者-Hannah Kent-Webb
生物化學學士學位和博士學位。英國諾丁漢大學藥理學博士學位。她目前是一名自由科學作家,為 Biocompare 製作定期內容。