光譜流式細胞儀指南
流式細胞術通過測量(通常)熒光染料標記的抗體的熒光來詢問生物學特徵,這些抗體對這些特徵具有特異性。它將細胞的不可見分子信息轉化為彩色光。可以使用不同的熒光同時詢問多個分子,以產生關於每秒數万個細胞的豐度和共表達的信息。
在過去十年中,一種用於解析每種熒光貢獻的新範式越來越受到青睞,它使研究人員能夠一次研究多達 60 種生物特徵。在這裡,我們討論光譜流式細胞術如何能夠捕獲該信息並將其轉化為有意義的數據,在此過程中指出與傳統流式細胞術相比的一些優勢。
常規流式細胞術
在傳統的流式細胞術中,用不同熒光染色的細胞通過一系列激發熒光的激光。根據熒光的特性,同一激光可以激發多種熒光。然後檢測器接收細胞通過時發出的光,向儀器報告每種顏色的亮度。每種不同的顏色都需要自己的檢測器。
然而,雖然熒光染料可以被特定波長的激光激發——比如,在用於激發 FITC、PE 和許多其他的藍色激光的情況下,488 nm——其發射光譜通常很寬。“因此,這意味著您從給定的熒光染料獲得的信號將傳播到許多檢測器,”BD Biosciences 高級技術組的副首席工程師 Peter Mage 說。“你得到了過去所謂的‘熒光溢出’。” 因此來自 FITC 的信號將主要在 FITC 檢測器中,但發射尾部會滲入 PE 檢測器。”
這在運行單色實驗時不是問題,但在同時使用染料(如 FITC 和 PE)時會成為一個問題,這會導致溢出到其他檢測器並人為地增加它們的信號。在所有檢測器中確定來自僅用單一熒光(單陽性)染色的細胞的信號,可以從數學上消除該熒光對其他熒光信號的相對貢獻——這一過程稱為“補償”。
然而,隨著用於檢測給定細胞的染料數量增加,它們的發射光譜重疊變得更加明顯,熒光組合之間的擴散使得補償變得更具挑戰性。考慮到儀器的帶通濾波器配置,光在到達檢測器的途中必須通過這些配置,因此在某些時候無法區分光譜。
注意差距:進入光譜流式細胞術
“光譜流式細胞儀由與傳統流式細胞儀相同的主要組件組成:射流、光學和電子設備,”Cytek ® Biosciences 技術應用專家 Laura Johnston 指出。整個工作流程,包括樣品製備、試劑和對照,也基本相同。
約翰斯頓指出,關鍵區別在於“光譜流式細胞儀使用更多的檢測器來捕獲盡可能多的全光譜。“雖然每個檢測器或通道捕獲的波長范圍很小,但檢測器的組合陣列可以捕獲全光譜,幾乎沒有間隙。”
然後可以根據所有檢測器陣列的信號強度,通過獨特的特徵來定義熒光染料。然後使用最初為衛星成像開發的數學過程對收集到的光譜進行解卷積,然後用熒光顯微鏡進行處理。“光譜分離”類似於傳統流式細胞術中的補償,梳理出單個熒光的貢獻,以便可以獨立評估它們。“我們不再局限於過濾器的狹窄範圍,”BD Biosciences 市場開發副總監 Mirko Corselli 在網絡研討會上解釋說。“我們唯一需要擔心的是我們是否有合適的激光來激發給定的熒光染料。”
光譜流式細胞儀的三大優勢
通常指出光譜流式細胞術的至少三個增量優勢或新功能。
重疊圖使用光譜流式細胞術,通常可以測量和利用具有相似、重疊發射的熒光分子——包括那些在傳統流式細胞術中被分配了相同檢測器的分子。
“有一個很大的警告,那就是雖然你可以在技術上做到這一點,……任何地方你有重疊的熒光從一種染料到另一種染料,你最終可能會增加測量噪音,”Mage 指出。Corselli 補充說,這樣的實驗具有挑戰性,“應該僅限於高價值面板或沒有其他選擇時”。
靈活性由於能夠利用高度重疊的熒光,“使用光譜細胞儀設計多色流式實驗或設計面板——你同時觀察的那組染料——會更靈活一些,”Mage 解釋說. 與其根據可用的檢測器選擇熒光劑,“如果我正在觀察的染料被我係統上的其中一個激光器充分激發,並且發射峰位於系統測量範圍內的某個位置(通常在大約 350和 850 nm),那麼我應該可以使用它。”
自體熒光(AF) 有些細胞——例如組織來源的樣本和細胞系——即使在沒有外源性染色的情況下也會發出熒光。 這會影響傳統流式細胞儀將自體熒光信號與同一檢測器捕獲的染料(例如 BD Horizon ™ BV510)信號分開的能力。“結果數據將顯示為 BD Horizon ™ BV510 參數中陰性群體的高背景,從而導致陰性和陽性群體之間的分辨率降低,”Johnston 解釋說。光譜流式細胞儀能夠定義自體熒光特徵並從總測量信號中提取其貢獻,從而提高背景和感興趣的真實熒光信號之間的分辨率。
“另一件事是 AF 本身可以成為一個有趣的生物學信息測量參數,”Mage 補充道。“它為您提供了一種無標記參數,可以與細胞週期相關,或者與細胞的刺激或活動相關。”
Mage 認為流式細胞術市場“正朝著使光譜更加標準的方向發展”。Corselli 對此表示贊同,並指出“光譜流已經在改變染料的面貌並改變我們開髮染料的方式。”
文章作者-Josh P. Roberts
喬什·P·羅伯茨 (Josh P. Roberts) 擁有科學史和科學哲學的碩士學位,並且還攻讀了博士學位。明尼蘇達大學分子、細胞、發育生物學和遺傳學項目,以及眼部免疫學論文研究。