通過手動和自動方法對細胞進行計數
許多基於細胞的測定的先決條件是了解樣本中的細胞總數或每孔的細胞密度。因此,準確計數細胞的能力是許多工作流程中重要的第一步,因此應優先考慮盡量減少因計數不准確而導致的數據可變性。細胞計數可以使用血細胞計數器或自動細胞計數器手動完成。本文回顧了當今實踐中的主要細胞計數方法,並提供了選擇方法或細胞計數儀器類型的注意事項。
用血細胞計數器手動計數
傳統的細胞計數方法包括將細胞樣本添加到血細胞計數器,然後使用明視野顯微鏡通過肉眼對細胞進行計數。血細胞計數器是一種載玻片,帶有蝕刻到玻璃中的經過特殊設計和校準的網格,因此您可以對可測量區域內可見的細胞進行計數。可以將活力染料添加到細胞樣本中以區分活細胞和死細胞,從而對整個樣本進行活力評估。
但與更新、更有效的自動細胞計數方法(見下文)相比,手動計數方法費力且可靠性較低。隨著自動細胞計數器的價格越來越便宜,依賴手動計數的理由已經減少。“研究人員繼續使用基於手動的方法的情況並不多,但一個原因是學生在實驗室學習細胞培養基礎知識時學習細胞計數背後的技術和數學,” DeNovix 的市場開發經理 Andrew Jones 說。
很少需要計數,再加上耐心,當然可以保證使用血細胞計數器。“手動計數是估計細胞計數的適當方法,”MilliporeSigma 監測工俱全球產品經理 Mahesh Dodla 說。“當研究人員不受時間限制並且不需要更精確的自動細胞計數器時,可以使用血細胞計數器。” 細胞樣本類型也可能是一個需要考慮的因素。Logos Biosystems 首席執行官 Neon Jung 補充道:“如果細胞高度聚集且難以分離成單個細胞,則與使用自動細胞計數器相比,手動細胞計數可能效果更好。”
電阻自動計數
大多數自動細胞計數器使用阻抗(在本文中也稱為電阻)或成像來對單個細胞進行計數。基於阻抗的計數器測量小通道上的阻抗。當電阻比周圍介質大的細胞阻塞通道時,阻抗測量值增加並且細胞被檢測到。
基於阻抗的細胞計數器在血液學中使用了幾十年,非常適合測量單個圓形細胞(即血細胞)的數量和大小。然而,大多數基於阻抗的計數器不測量細胞活力,這對於依賴它的實驗室來說可能是一個交易破壞者。“實驗室中使用的大多數細胞具有復雜的形態,以簇狀形式存在,需要進行活力測量以監測細胞健康狀況,”Jung 說。儘管如此,基於阻抗的計數器在準確性方面可以與基於圖像的計數器相媲美。“基於阻抗的細胞計數器更準確,變異係數更低,”Dodla 解釋說。MilliporeSigma 的手持式 Sceptre™ 3.0 是一款實驗室佔地面積小的便攜式型號,是一種基於阻抗的計數器,可以在任何地方使用,包括在細胞培養罩內。
成像自動計數
基於圖像的自動計數器使用顯微鏡和圖像分析算法對細胞進行計數,這些算法能夠區分活細胞和死細胞。自動化此過程消除了個體研究人員對細胞計數和活/死鑑定帶來的主觀性,從而減少了總體結果的可變性。“[基於圖像的] 計數器通常還會執行細胞密度、活力和稀釋體積等計算,避免下游處理的潛在錯誤和下游應用中代價高昂的故障,”瓊斯說。
基於圖像的計數器還可以提供有關細胞形態和感興趣的熒光標記分子表達的信息。“細胞可以用多種熒光標記物染色,以評估細胞活力、細胞凋亡和轉染效率,”安捷倫戰略營銷經理 Bikram Chakraborty 說。“此外,可以為廣泛的定量顯微鏡應用設計圖像分析算法,在這些應用中,可以使用熒光探針根據所需表型的表達對細胞進行計數。”
基於圖像的計數器還提供有助於監測細胞健康的圖像。“在進入下游流程之前,這可以作為一個很好的質量控制,”瓊斯說。“保留細胞圖像記錄通常是與下游應用技術供應商進行故障排除的重要因素。”
一些研究人員可能擔心自動化系統產生的額外耗材成本和生物危害廢物,但無耗材的替代品正在出現。“開發使用 DirectPipette™ 技術的 DeNovix CellDrop 自動細胞計數儀是為了消除此過程中的塑料浪費和耗材成本,”Jones 指出。
在地平線上
具有新功能的自動細胞計數儀不斷發展。“一些新的計數器可以一直放在細胞培養箱中,這樣就可以在培養箱中進行細胞培養視頻和細胞計數,”Dodla 說。Chakraborty 指出,未來幾年,無標記細胞計數和分析技術可能會變得更加實用。“[我還期待] 用於無標記細胞計數的新軟件算法,這可以幫助研究人員研究細胞圖像而無需干擾染色,同時節省試劑成本,”他們說。
一些使用細胞計數器的實驗室也需要對細胞核進行計數。“一直在推動提高新一代自動細胞計數器的通量,以服務實驗室進入單細胞測序工作流程等應用程序,”瓊斯說。“許多這些單細胞測序實驗室需要細胞核計數,而不僅僅是細胞計數,因此細胞計數器已經開始提供定制的應用程序,以快速準確地為這些實驗室提供計算分離細胞核所需的答案。” 儘管方法各不相同,但當今可用的所有細胞計數工具都旨在讓您更輕鬆地準確可靠地對細胞進行計數。
文章作者-Caitlin Smith
凱特琳·史密斯 (Caitlin Smith) 擁有里德學院的生物學學士學位和博士學位。在耶魯大學獲得神經科學博士學位,並在 Vollum 研究所完成了博士後工作。