測量細胞增殖
增殖是細胞週期研究中最基本的測量指標之一。但是有這麼多不同的細胞增殖試驗可供選擇,您應該選擇哪一種?
為什麼要測量細胞增殖?
研究人員測量細胞增殖的原因有很多。據ATCC生物內容部主任田方介紹,這些包括幹細胞更新、組織修復和免疫反應等生物過程的研究,以及藥物療效和毒性作用的評估。“細胞增殖也在常規細胞培養工作流程中進行測量,”她說。“它不僅可以驗證細胞健康狀況,還可以標記給定的細胞培養物是否遇到了遺傳漂變、表型變化或潛在污染。”
Promega 高級研究科學家 Dan Lazar 補充說,測量細胞增殖在腫瘤細胞和免疫細胞的免疫腫瘤學研究中也很重要。“研究人員希望了解增殖標誌物的變化,包括細胞週期調節因子,作為癌症進展的預後指標和潛在治療方案的指南,”他報告說。“此外,T 細胞增殖是了解 T 細胞是否被激活並準備好擴大其數量以攻擊癌細胞的有用標記。”
細胞增殖試驗的類型
用於測量細胞增殖的測定可大致分為直接法和間接法。測量DNA 合成是一種直接方法,通常基於流式細胞術、成像或使用酶標儀。“這些類型的測定涉及將活細胞與胸苷類似物(如 BrdU 或 EdU)一起孵育,並使用熒光團標記的抗體監測其摻入新合成的 DNA 中,”CytoSMART Technologies 應用科學家 Marc van Vijven 博士解釋道。“雖然非常精確,但它們受到復雜的多步驟協議以及它們通常提供終點讀數這一事實的限制。”
另一種直接方法涉及測量細胞週期標記物的表達,同樣是通過免疫染色。常見標記物包括有絲分裂特異的磷酸化組蛋白 H3 (Ser10);Ki67,僅由增殖細胞表達;和 PCNA,一種參與 DNA 複製的滑動鉗蛋白。Van Vijven 還強調了基於熒光泛素化的細胞週期指示劑 (FUCCI),它利用孿蛋白和 Cdt1 的有絲分裂階段依賴性表達在 G1 期間提供紅色熒光信號,在 S、G2 和 M 期間提供綠色熒光信號,以及在活細胞成像研究中很受歡迎。
測量染料稀釋度是跟踪細胞增殖的一種間接方法。“羧基熒光素琥珀酰亞胺酯 (CFSE) 是一種熒光染料,幾十年來一直用於評估免疫群體,”MilliporeSigma 高級細胞培養全球產品經理 Robin Clark 博士報告說。“當細胞增殖時,父細胞中存在的 CFSE 在每個子細胞中實際上減半,因此每個新一代的亮度都是其父細胞的一半。然後通過流式細胞術進行分析,根據熒光強度的減弱以及每一代中的細胞數量,揭示出清晰的群體世代。”
增殖和生存能力不應混淆
大多數用於測量細胞增殖的間接方法都是基於活力,它指的是群體中活的健康細胞的數量。值得注意的是,並非所有活細胞都一定會增殖——相反,增殖細胞代表了活細胞群的一個子集。
“四唑還原、刃天青還原和蛋白酶活性測定都涉及將試劑與活細胞一起孵育並監測其向有色或熒光產物的轉化,”Tian 解釋說。“當細胞死亡時,它們會迅速失去這種能力,因此信號測量值與存在的細胞數量成正比。雖然這些類型的檢測反映的是活細胞代謝,而不是具體的細胞增殖,但它們具有靈敏度高和易於使用的優點。”
培養物中的活細胞數量也可以通過測量 ATP 含量來確定,例如使用 CellTiter-Glo 2.0 Assay或 BioTracker ATP-Red Live Cell Dye。“ATP 測定很容易小型化為 384 孔和 1,536 孔格式,可以同時篩選多種抗增殖化合物,”Lazar 指出。“它們還可以與其他細胞參數進行多路復用,以幫助了解增殖與改變的生存能力——例如,與 DNA 結合染料進行多路復用以測量總 DNA 含量,或與細胞死亡標記進行多路復用。”
最終,在可用的不同分析格式之間進行選擇將取決於您的研究目的,以及可用的儀器、需要分析的樣本數量、需要的靈敏度水平以及您是否要測量樣本時間。“如果需要直接測量有絲分裂率特有的變化,那麼檢測磷酸組蛋白 H3 可能是一個不錯的選擇,”Clark 說。“對於具有增殖潛力的活細胞的高通量評估,您可能決定使用基於四唑鹽(如 MTT 或 XTT)的活力測定。在需要隨時間追踪細胞分裂的情況下,染料稀釋測定可能是首選。”
細胞增殖的活細胞成像
由於其提供的優勢,使用活細胞成像測量細胞增殖正在蓬勃發展。至關重要的是,活細胞成像系統避免了從受控培養箱環境中移除細胞的需要,並且可以在比較時間點時消除作為變異來源的樣本間不一致。隨著時間的推移跟踪細胞增殖也最大限度地減少了必須準備的樣本數量。
“諸如CytoSMART Omni FL之類的 CytoSMART 活細胞成像設備 具有集成的匯合模塊,使用戶能夠使用明場和/或熒光通道測量細胞隨時間的增殖,”Van Vijven 說。“除了提高質量控制的準確性外,由活細胞成像系統介導的定量分析正在越來越多地用於腫瘤學研究,其目的是評估癌細胞在接觸潛在候選藥物或細胞療法時增殖能力的降低”
原始明場圖像(左)和用於隨時間監測的 3T3 成纖維細胞融合度量化(綠色;右)的 CytoSMART 算法的相應疊加。顯示了實驗開始和結束(t = 30 小時)的圖像。
文章作者-Emma Easthope
Emma Easthope 是總部位於英國的 Cambridge Technical Content Ltd 的創始人兼董事。自 2000 年從坎特伯雷的肯特大學獲得生物學學士學位以來,她在包括 Millennium Pharmaceuticals、Millennium Pharmaceuticals、阿斯利康和 Cellzome。她現在製作範圍廣泛的科學內容,包括 Biocompare 的常規功能。