天然 LC/MS:在基於蛋白質的應用中邁出下一步
蛋白質是動態實體,充當細胞表型的關鍵介質。表徵這些蛋白質的努力始於使用質譜法 (MS) 來確定它們的分子量和肽序列。然而,蛋白質的特徵不僅僅在於它們的肽序列。非共價蛋白複合物,即那些涉及分子相互作用而不是直接共享電子的複合物,會影響蛋白質的穩定性、功能,並最終影響所涉及分子的生物學影響。沃特世高級生物製藥市場開發經理 Scott Berger 解釋說,當希望對這些複合物進行整體分析時,“在樣品製備、分析物分離和質量檢測過程中保持這些相互作用是一項基本的表徵挑戰。
天然液相色譜/質譜 (LC/MS) 改變了這種動態。LC/MS 通過允許蛋白質在進入質譜儀時保留其結構來調整現有的 MS 方法。通過這樣做,科學家們現在可以開始研究蛋白質複合物以及與其他生物分子的相互作用。這反過來又促進了開發新型生物治療藥物和確保這些治療藥物質量控制的努力。
什麼是原生 LC/MS?
本機 LC/MS 需要修改現有的 MS 方法。原生 LC/MS 使用較軟的電離條件,在蛋白質轉變為質譜儀源區域內的氣相離子時保留蛋白質內部和蛋白質之間的非共價相互作用。1個“在原生 LC/MS 中,生物分析物通過應用電勢輔助噴霧過程電離,要求 LC 流動相包含揮發性‘MS 友好’和‘複合物友好’成分,”Berger 解釋道。“被稱為電噴霧電離質譜 (ESI-MS) 的窄毛細管發射器分散含有揮發性鹽和緩沖劑(如醋酸銨和甲酸銨)的高電荷水滴的精細噴霧。在中等水平下,這些揮發性鹽不會顯著破壞電噴霧羽流,也不會破壞分析物的非共價相互作用。一旦帶電液滴被分配,MS 源區域中的真空促進蒸發有助於去除大量溶劑和揮發性鹽,
天然 LC/MS 中的色譜法——增強蛋白質分離
對 ESI-MS 的修改還可以通過其他特徵進一步區分蛋白質。這些特性包括疏水性、離子電荷和大小——所有這些都會影響蛋白質的結構和活性。產生這些改變是因為 ESI-MS 在沒有初始分離步驟的情況下無法解析蛋白質亞型。2個
上述分離可以通過質譜分析之前的層析步驟來完成。一種這樣的方法,尺寸排阻色譜-質譜法 (SEC-MS),在進行質譜法之前首先按分子量分離蛋白質聚集體。3 SCIEX 生物製藥應用和技術營銷高級經理 Zoe Zhang 也提請注意離子交換色譜-質譜 (IEX-MS),“蛋白質也可以通過它們的蛋白質形式來區分,這是許多分子形式中的一種,其中可以找到來自單個基因的蛋白質產物。蛋白質的電荷代表了可以將一種蛋白質與另一種蛋白質區分開來的變量之一。IEX-MS 根據它們的淨電荷分離這些蛋白質形式。”
沃特世還開發了一種新的基於離子淌度的分離方法,為本地 LC/MS 分析增加了附加值。質譜儀內的離子淌度元件使這些 ESI 生成的分子離子能夠在氣相中分離,不僅像在傳統 MS 分析中那樣通過它們的質量和電荷,而且通過它們的平均碰撞橫截面測量的形狀(CCS)表面積值。4個Berger 解釋瞭如何使用此特性以這種方式進一步分離 MS 內的蛋白質和復合物,“離子淌度通過確定它們在儀器低壓區域中移動的有效阻力來解析會產生相同測量分子量的蛋白質離子. 想想等效的空氣阻力。在這裡,具有相同分子量的兩種蛋白質將根據蛋白質的構象排列或結合狀態具有不同的離子淌度。換句話說,更緊湊的蛋白質或複合物比具有更廣泛結構的蛋白質或複合物傳播得更快。這使我們能夠監測蛋白質的高階結構、相互作用和結構動力學。”
通過本地 LC/MS 生成的見解
天然 LC/MS 為蛋白質之間的非共價相互作用提供了寶貴的見解。這些相互作用的闡明部分歸功於 MS 能夠以更高的質荷比識別生物分子。據 Zhang 介紹,“MS 中採用的基於飛行時間 (TOF) 的方法可產生廣泛的質量範圍以檢測蛋白質,使天然 LC/MS 可用於研究完整蛋白質和進行大型物種分析。” 天然 LC/MS 還可以提供有關複合物內亞基化學計量的信息,在 MS 中應用升高的電壓可以告訴我們蛋白質複合物是如何通過它們分解時形成的亞複合物模式組裝的。Berger 補充說,“使用天然 LC/MS,我們可以進行結構研究,觀察複合物的亞基結合模式,
應用——質量控制
天然 LC/MS 為蛋白質表徵提供的優勢可應用於生物治療藥物研發。例如,在開發基於蛋白質的生物治療藥物時,批次間差異是一個主要問題。5這在為各種應用生產抗體時尤其普遍,降低了特異性。6天然 LC/MS 提供了多種機會來提高治療性蛋白質生產的一致性。例如,ESI-MS 已被用於表徵治療性單克隆抗體曲妥珠單抗生產過程中存在的不同糖型的類型和豐度。7Zhang 解釋說,“許多非共價相互作用發生在蛋白質之間或蛋白質與小藥物之間,這可能會顯著影響藥物療效並可能導致安全問題。因此,使用原生 LC/MS 識別這些相互作用對於改進在原生條件下治療疾病的療法的開發非常重要。”
應用——抗體-藥物偶聯物
當結合的藥物共價連接到由減少的鏈間二硫鍵產生的 Cys 殘基時,抗體藥物偶聯物 (ADC) 可以依靠非共價相互作用來維持抗體結構。8個Berger 吹捧原生 LC/MS 能夠保持整體觀察 ADC 分子的能力,“更強大的 ADC 可以保持規範的雙重鏈/雙輕鏈配對結構,即使在缺乏橋聯二硫化物時,當它們被分離時,並且使用不會將分子分解成碎片的條件檢測到質量。使用在線體積排阻和適當的揮發性緩衝液進行天然 LC/MS 有助於我們確定每個分子中有多少半胱氨酸殘基含有 Cys 偶聯藥物,而反相 LC/MS 分析會釋放二硫化物釋放的亞基用於分離分析。”
結論
本機 LC/MS 代表了對反相 MS 的升級,用於表徵完整蛋白質。傳統的 MS 技術需要蛋白質碎裂來進行表徵,而天然 LC/MS 允許蛋白質保留其結構特性。天然 LC/MS 促進了改進基於蛋白質的生物治療藥物的質量控制和開發 ADC 作為抗癌治療的新型藥物的努力。然而,天然 LC/MS 作為量化蛋白質豐度的工具以及在梳理異質蛋白質複合物時面臨著局限性。
文章作者-Paul Naphtali
Paul Naphtali 擁有理學碩士學位。在麥克馬斯特大學獲得生物學博士學位,他的研究重點是使用下一代測序技術追踪地下水糞便污染。他還獲得了博士學位。麥克馬斯特大學生物化學和生物醫學科學專業,他的論文研究重點是使用生物信息學工具進行基因組註釋、轉錄組學和基於分子的分析來研究囊性纖維化氣道感染。