表徵生物治療藥物:使用液相色譜法進行質譜分析的樣品製備
樣品製備是質譜(MS) 分析中至關重要的第一步,具有強烈影響最終結果的能力。
液相色譜法是在 MS 之前使用的一種常見樣品製備技術,尤其是在表徵生物治療目標分子(如單克隆抗體和抗體藥物偶聯物 (ADC))時。
這裡討論的是目前用於在生物治療藥物的分析和表徵中製備 MS 樣品的液相色譜技術。
簡化複雜樣品
樣品製備通常包括在 MS 分析之前降低生物治療藥物的複雜性。用於此目的的常用固定相包括尺寸排阻色譜 (SEC)、離子交換 (IEX) 色譜、疏水相互作用色譜 (HIC) 和反相 (RP) 色譜。
Thermo Fisher Scientific在這些模式下提供了一系列 Thermo Scientific ™ MabPac ™色譜柱,用於分析完整的生物治療藥物。MAbPac 色譜柱可用於在 Thermo Scientific Vanquish UHPLC 平台上進行超 HPLC 分離之前分離組分。Thermo Fisher Scientific 一直與愛爾蘭國家生物加工研究與技術研究所 (NIBRT) 就 SEC 開展合作,並優化了 Vanquish UHPLC 系統的設置。此外,Thermo Scientific ™ Q Exactive ™ BioPharma 平台針對分析天然完整蛋白質進行了優化。
沃特世開發了一種在線 SEC-MS 方法,將生物治療藥物考慮在內。該公司的二醇塗層 BEH SEC 色譜柱可用於分析原始形式的高階結構。“這也用於半胱氨酸修飾的抗體-藥物偶聯物,這些偶聯物可能含有攜帶兩條重鏈的二硫化物被藥物偶聯過程破壞,並且會在 MS 檢測之前在變性條件下分崩離析,”高級營銷人員 Scott Berger 說沃特世生物製藥業務運營經理。BEH SEC 色譜柱還可用於分離變性完整靶標的亞基。
二維液相色譜 (2D-LC)——先進行 LC 分析,然後對第一個洗脫液進行第二次 LC 分析——也可以在 MS 之前提供更好的組分分離。安捷倫科技公司為尋求集成二維液相色譜解決方案的研究人員提供了 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜系統。“使用 2D-LC,研究人員無需先收集單個餾分,然後將樣品重新註入 LC-MS 系統,就可以加快他們的整個分析工作流程,”安捷倫科技生物製藥開發營銷經理 Michael Yap 說。“2D-LC MS 還提供更高的分離維度和更高的分辨率,從而更好地表徵複雜的生物治療樣品。”
包括安捷倫科技在內的多家供應商正在幫助簡化從 LC 到 MS 的工作流程。一些 LC 緩衝液(例如 IEX 或 SEC 中使用的緩衝液)含鹽量高,使其與下游 MS 不兼容——高鹽流動相會干擾電噴霧 MS 電離過程。安捷倫科技公司使用帶有 RP 小柱或捕集柱的脫鹽策略,可實現直接在線 2D-LC MS 分析。安捷倫還提供自動化 AssayMAP Bravo 平台,該平台專為 LC-MS 分析前的可重現樣品製備而設計。
島津科學儀器公司還提供了一種新的多維樣品製備解決方案。島津與 Perfinity Biosciences 合作開發了自動化 Perfinity 平台,用於製備用於多維 MS 分析的抗體。該平台包括親和選擇、胰蛋白酶消化、脫鹽和最終分離。“該方法提供 10 分鐘的循環時間,是用於 IgG 肽定量的可重現的免疫 MS 平台,可應用於許多其他肽和蛋白質應用,”島津科學儀器公司藥品營銷經理 Gurmil Gendeh 說。
分離目標
生物治療藥物的研究通常是通過將它們分開來進行研究——例如,通過肽圖分析,其中目標蛋白質被消化,其產生的肽由 MS 分析。Thermo Scientific ™ SMART Digest ™試劑盒旨在提高生物治療藥物肽譜的重現性和簡化消化。Thermo Fisher Scientific 色譜和質譜的製藥和生物製藥垂直營銷經理 Rowan Moore 建議使用 Thermo Scientific™ Acclaim™ Vanquish™ C18 UHPLC 色譜柱進行後續的肽分離。“它與 Vanquish UHPLC 系統協同工作,提供低濃度肽的高分辨率,”她說。“我們對分析宿主細胞蛋白質並以‘串聯’模式運行 Vanquish UHPLC 以提高該色譜柱的肽譜分析通量的工作感到非常興奮。”
島津科學儀器公司最近發布了 nSMOL 抗體生物分析 (BA) 試劑盒,旨在通過 LC-MS/MS 對生物體液中的抗體藥物進行定量。該試劑盒試劑能夠選擇性地水解血液或其他生物樣品中單克隆抗體的 Fab 區。“通過使用三重四極桿 HPLC 質譜儀進行 MRM 測量,可以準確量化由有限蛋白水解產生的 Fab 衍生肽片段,”Gendeh 說。根據 Gendeh 的說法,將這種方法用於抗體等大分子的一個優勢是選擇性碎裂產生的肽片段更少,這有助於抑制背景噪聲和離子抑制。
糖蛋白和糖肽
將生物治療藥物分開的另一種方法是研究附著在蛋白質或肽上的糖。一種方法是從靶標上切割糖,然後分析釋放的游離聚醣。另一種方法是研究完整的糖蛋白或糖肽及其附著的糖。安捷倫科技公司提供 HIC 色譜柱,用於游離 N-聚醣以及糖肽和糖蛋白的聚醣分析。沃特世最近開發了一種新的大孔 HILIC 化學物質,可在其 BEH HILIC 糖蛋白色譜柱中使用,用於糖蛋白和糖肽的在線 LC-MS 分析,以及對較大的游離標記聚醣結構的優化分析。
由於聚醣是親水性的,它們會影響相對疏水的肽或蛋白質在 LC 過程中與色譜柱的相互作用。
“使用傳統的 RP-LC-MS 方法分離糖型通常不那麼有效,因為分子肽部分的疏水性決定了色譜柱的相互作用,”Berger 說。“我們的大孔 HILIC 方法使研究人員能夠構建專注於研究抗體和其他生物治療糖基化的分析,而不受大多數非糖基化肽的干擾。”
對於游離聚醣的分析,Thermo Scientific ™ GlycanPac ™ LC 色譜柱使用混合模式色譜柱同時實現一種以上的分離。它們能夠通過大小、電荷、極性和異構體類型解析天然或標記的聚醣,這“對於分析從高度帶電的唾液酸化生物製劑(如依那西普)釋放的聚醣非常有用,”摩爾說。
Thermo Scientific ™ Accucore ™ 150 Amide HILIC 液相色譜柱更適合單克隆抗體的聚醣分析,單克隆抗體的帶電聚醣水平通常較低。“雖然確實存在一些用於通過 MS 放大聚醣信號的市售試劑盒,但我認為在該領域仍有待觀察的重大進展,”摩爾說。
沃特世還開發了 ionKey-MS 系統,這是一種用於微型反相分離的陶瓷微流體裝置。這對於使用微量或極其有限的樣品材料的生物治療研究人員來說是有價值的——例如篩選早期克隆、在小體積細胞培養系統中生長時——以及旨在優化生物治療蛋白的生產。ionKey-MS 技術還用於臨床前研究,“其中生物流體樣本很少,並且需要高靈敏度來跟踪分子和關鍵變體,從高劑量的高水平到隨著生物治療劑的清除而低得多的水平,”伯傑說。
有一件事是肯定的:科學家不能只選擇一種工具。生物治療藥物非常複雜,需要分析完整分子、它們的亞基和單個肽水平或游離聚醣。通過結合所有這些級別的分析,科學家們正在迅速將生物治療學的發展推向新的發現和治療應用。