液相色譜在結垢方面的挑戰
處理跨規模的液相色譜 (LC) 分離——例如,從不到一升到數百——需要改變設備和耗材。許多行業,尤其是生物製藥生產商,需要能夠在任何感興趣的規模上產生相同或非常相似的結果的方法。事實證明,擴展挑戰朝著一些意想不到的方向發展。
“縮放色譜法面臨兩個主要挑戰,”技術創新中心CPI的首席技術專家和高價值製造彈射器的創始成員John Liddell 說。“其中第一個更值得期待,即從實驗室擴大到試點或全面商業規模。” 然後,他補充說,“第二個擴展挑戰不太受歡迎,即縮小色譜法以允許應用基於使用在多並行自動化設備中運行的微型色譜柱的高通量工藝開發方法。”
無論放大還是縮小 LC,科學家都面臨著挑戰。一系列因素決定了問題的複雜性,並且一些個人偏好會影響處理任何障礙。
降低成本
在倫敦大學學院,生物化學工程系生物過程分析教授Daniel Bracewell使用各種形式的色譜法,包括親和和離子交換。“我們擴展這些流程並考慮在該流程中可能和確實會出錯的事情,”他解釋道。
Bracewell 和他的同事牢記的一件事是成本。“工業需要一定數量的周期——比如 100 個——從柱子中取出,”他說。這需要柱子中的樹脂能夠保持那麼久。“小規模的循環研究可能需要幾個月的時間才能了解樹脂的壽命,”他指出,“但在研究生物製藥時,監管機構需要這些數據。” 此外,填充生產規模的色譜柱可能需要超過 100 萬美元的樹脂。因此,公司希望運行盡可能多的周期。
圖片:液相色譜樹脂隨時間老化。圖片由 Daniel Bracewell 提供。
在考慮如何將工藝從實驗室規模擴大到工業運營時,開發人員需要考慮樹脂的其他方面。“你要檢查所有的試劑和樹脂本身,確保沒有問題,”Bracewell 說,“比如確保你能採購到足夠多的正確等級的樹脂。”
為一個目的而準備
一種尺寸並不能適用於所有色譜法,儘管一些科學家過去不這麼認為。正如 Thermo Fisher Scientific 色譜化學副總裁 Chris Pohl 所說,“當我第一次開發生物色譜固定相時,普遍的說法是你需要一個既適合分析目的又適合製備的固定相,但最好是為您要使用它的目的定義一個階段。”
否則,過程將始終基於妥協。例如,分析色譜最重要的特徵是分辨能力,但對於製備色譜來說是容量。“這兩個參數有時會不一致,”Pohl 解釋道。
當增加規模時,科學家需要記住必須處理多少材料。儘管許多色譜柱製造商指定了靜態載量,但 Pohl 指出動態載量是要牢記的指標。正如他所問的那樣,“在真實條件下你能注入多少?” 這才是真正重要的。
此外,Pohl 還提到了殘留物,即前一次注射的量可能會干擾下一次注射。“如果遺留物太多,”他說,“那麼你將無法成功地將媒體擴大到更大的規模。”
正如 Pohl 總結的那樣,“動態負載能力和殘留是您一開始就關注的事情。” 然後,其他功能也開始發揮作用。
圖片:Thermo Fisher Scientific 的研究人員開髮用於分析和工藝規模液相色譜的顆粒。
儘管 Thermo Fisher Scientific 開始專注於分析級色譜,但 Pohl 和他的同事正在研究可能對工藝規模有效的顆粒。簡而言之,他們正在製造 25 微米的色譜顆粒,上面塗有納米級顆粒,具有非常低的非特異性結合。“我們已經將它用於分析規模,”Pohl 解釋說,“但我們正在努力為工藝規模製造更大的粒徑。”
在任何方向
儘管有許多特定於分離的問題需要解決,但一些相似之處簡化了科學家的生活。“幸運的是,類似的方法有助於確保根據一些簡單的指南成功擴大和縮小規模,”Liddell 說。“該方法應包括在所有規模上使用相同的珠粒大小/等級的層析介質——即,相同類型的介質和珠粒大小,基於在所有規模的步驟中保持相同停留時間的流速,以及所有層析方案中步驟的體積——例如平衡、洗脫等——相對於色譜柱的體積。”
Liddell 指出,在擴大規模時,人們傳統上會使用更大的色譜柱和更強大的泵。“放大協議將包括使用相同的層析珠、停留時間和與所有規模的柱體積相關的步進體積,”他說,但這不是唯一的方法。
在 CPI,Liddell 和他的同事使用其他方法。“其中第一個是連續色譜,我們一直在與英國的一個主要財團合作——其中包括 Pall Biosciences、葛蘭素史克、阿斯利康、艾爾建、CPI、Fujifilm Diosynth Biotechnologies 和 SCIEX——開發連續色譜工藝,”他說。“與其使用更大的基於批次的設備來提供足夠高的產品產量,更小的連續色譜可以提供相同數量和質量的產品。”
在另一種擴大規模的方式中,CPI 正在使用“能夠在高流速下運行的非珠色譜吸附劑,以便可以快速循環小型設備以提供與大型色譜柱相同的生產率,”Liddell 解釋道。CPI 與 Cobra Biologics 和 GE Healthcare 合作,將這項技術應用於一項基於腺相關病毒 (AAV) 的基因療法的研究,該療法被考慮用於治療血友病等單基因遺傳疾病。在這個項目中,“CPI 使用新型 Fibro 吸附劑(由Puridify開發)操作 AAV 生產的完整工藝,上游工藝與下游純化相連,現在是通用電氣的一部分,”利德爾說。“這證明了使用這些新療法進行快速循環的概念,並證實可以通過緊湊和低成本的純化介質實現高生產率以及高產品質量。”
因此,無論是放大還是縮小,科學家們都使用一系列方法和工具來保持色譜法以最有效和高效的方式工作。手頭的流程將推動許多決策,只有在這個快速發展的領域擁有紮實的專業知識才能產生最佳結果。
Thermo Fisher Scientific 提供的乳膠團聚超大孔樹脂主圖
文章作者-Mike May
Mike May 獲得了康涅狄格大學的生物工程碩士學位和博士學位。康奈爾大學神經生物學和行為學專業。他曾擔任 American Scientist 的副主編,並為包括Nature、Science、Scientific American等 在內的客戶撰寫了數百篇文章。