聚醣分析的新方法
蛋白質糖基化是造成許多蛋白質化學多樣性的原因,尤其是單克隆抗體。儘管有幾種類型的糖基化是可能的,但 N-和 O-糖基化(分別發生在含氮和含氧殘基上)是研究最多的,被認為是 mAb 和其他治療性蛋白質的關鍵質量屬性。
聚醣表徵通常通過三個 LC-MS 工作流程之一來實現。最直接的方法是完整質量分析,因為它涉及整個未修飾的蛋白質,因此需要最少的樣品製備。Thermo Fisher Scientific 製藥/生物製藥應用高級經理 Min Du 博士說,常規對單克隆抗體進行完整質量檢測。“這種快速分析揭示了主要聚醣的全球糖型分佈,但存在低發生率聚醣的敏感性問題。”
在光譜的另一端是釋放聚醣分析,其第一步是從蛋白質上的結合點酶促釋放聚醣,然後對完整聚醣或其組成單醣進行 LC-MS 分析。
在這兩者之間,肽圖分析使用特定的蛋白酶(包括胰蛋白酶)來生成用於後續分析的小肽。肽圖分析產生高度靈敏的位點特異性聚醣譜。
多屬性分析
與標準正相或反相 HPLC 不同,釋放的聚醣方法採用帶脈衝電流檢測 (HPAE-PAD) 的高性能陰離子交換色譜。HPAE-PAD 將高靈敏度陰離子交換分離與電化學檢測相結合,避免了檢測前的衍生化,並對總糖基化和單個單醣進行量化。
HPAE 為 LC-MS 提供了用於表徵聚醣的補充信息,具有以下優勢:
- 與 MS 無縫集成
- 無需衍生化的樣品製備,可降低數據噪聲,同時避免樣品降解
- 適用於從中性到高電荷的多種聚醣,有助於分析酸性糖組(例如唾液酸化、硫酸化和磷酸化)
- 通過專業的色譜柱技術,解析結構異構體的能力
一種新興的方法是多屬性方法 (MAM),除了截斷、異構化、氧化、脫酰胺和其他翻譯後修飾等其他關鍵質量屬性外,它還提取糖基化和蛋白質序列的數據。
“與傳統的釋放聚醣分析相比,MAM 的主要驅動因素之一是在產品開發、製造和釋放測試期間可以使用單一 LC-MS 方法直接監測多個屬性,以提高運營效率並確保產品質量和安全,”杜告訴 Biocompare。一些公司正在將 MAM 用於在線過程分析。
正如安進公司的 Anurag S. Rathore 在 2021 年 1 月的 LCGC 文章中指出的那樣,“MAM 允許在整個生命週期內監測生物製藥,並且隨著自動化(自動取樣)和數據分析的進步,從生物反應器取樣,然後進行樣品清理, MAM 將能夠提供近乎實時的產品測量。隨著時間的推移,MAM 將被更多地視為我們過程分析技術 (PAT) 工具箱中的工具。”
便於使用
聚醣多樣性既是詛咒也是祝福。即使對於由兩種糖組成的聚醣,組合的可能性在理論上也是無限的(儘管在實踐中受到生物體和可用糖的限制)。另一方面,糖基化蛋白質種類的聚集體已被用作質量標誌來比較批次或生產方法,例如在建立生物相似性方面。
據查爾斯河實驗室生物製品解決方案科學顧問 Andrew Hanneman 博士稱,由於該方法易於使用,通過熒光標記進行的疏水相互作用 HPLC 分析已成為 mAb 常規質量分析和可比性研究的主導。“QC 實驗室中的高分辨率 MS 提供完整和亞基 LC-MS,包括天然質譜,用於快速批次間聚醣分析。其他技術包括 MALDI-TOF MS 和熒光標記聚醣的毛細管電泳 (CE)。 ”
同時,由於糖缺乏合適的髮色團,在線聚醣分析仍然具有挑戰性。“但在線質譜正在興起,尤其是使用小型且堅固的光譜儀。當快速了解糖基化作為關鍵質量屬性至關重要時,高分辨率儀器越來越接近生產線。
此外,快速熒光標記現在可以提供更快的讀數,而使用順序質譜法的從頭聚醣分析可以處理新的和不尋常的結構,在某些情況下可以小規模取代 NMR。
O-聚醣——一個特例?
聚醣釋放方法對 N-聚醣非常有效,因為 PNGase 可以有效去除範圍廣泛的 N-聚醣。也存在去除 O-聚醣的酶,但它們對某些糖蛋白(序列偏差)顯示出高選擇性,它們僅去除單醣或二糖核心聚醣,並且不釋放帶有唾液酸的 O-聚醣。
非常有效的化學解離會引發下游級聯化學消除,從而降解目標分析物。通過引入還原劑可將這種影響降至最低,但這限制了隨後的熒光標記。另外(所有的釋放和分析方法都是如此)一旦聚醣被釋放,就無法判斷它“屬於”哪個氨基酸。
新英格蘭生物實驗室 (NEB) 的一個小組已將一種新的 O-糖蛋白酶技術商業化,該技術基於來自銅綠假單胞菌的免疫調節金屬蛋白酶 (IMPa) 。最近的一篇期刊 文章強調了這項工作。
研究人員使用一系列合成測試糖肽來表徵 IMPa 的特異性。他們發現 IMPa 耐受切割位點附近的任何殘基,除了天冬氨酸,並且對不同 O-聚醣結構複雜性的糖蛋白具有完全的活性,包括支鍊和唾液酸。該論文還概述了兩種治療性糖蛋白的一步 O-糖蛋白組學工作流程。
NEB 的科學總監 Christopher Taron 說,唯一的缺點是該方法在裂解位置使用天冬氨酸時效果較差。
“這意味著在天冬氨酸之前連接在絲氨酸/蘇氨酸殘基上的一些 O-聚醣可能會被遺漏。這不是一個主要缺點,而是需要了解一些知識,以便可以適當地解釋蛋白質組數據。”
O-糖蛋白酶裂解後會發生什麼?
“你會得到一種糖肽混合物,每個物種的 N 端氨基酸上都含有一個 O-聚醣,”Taron 補充道。可以使用基於 MS 的蛋白質組學分析此糖肽庫以確定 O-糖苷(例如,繪製存在的肽)和占據每個位點的結構範圍。因此,儘管分析人員希望擁有更強大的 O-聚醣釋放和分析方法,但利用 O-糖蛋白酶的方法數據更豐富,因為它在同一實驗中提供糖位點位置和 O-聚醣結構信息。”
這是“一個重要的信息層”,Taron 說,典型的釋放和分析方法錯過了 O-聚醣。“與 N-聚醣相比,O-聚醣通常高度聚集在許多醣蛋白中。O-聚醣所在的絲氨酸和蘇氨酸殘基在計算上不容易預測 – 與具有保守規範附著位點的 N-聚醣相反。因此,O-聚醣分析存在兩個關鍵信息層:每個 O-糖苷位的位置和可以佔據每個位點的 O-聚醣結構。”