使用流式細胞儀進行細胞週期分析
流式細胞術是分析細胞週期的首選技術。本文評論了該方法是如何演變的,並分享了一些有助於簡化工作流程的策略。
流式細胞術是細胞週期分析的基礎
研究人員研究細胞週期以評估細胞健康、基因毒性和藥物功效,並了解細胞週期失調如何與癌症、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病等疾病相關聯。細胞週期知識對於優化生物反應器中生物藥物的生產以及提高主要作物的生物量和產量也很重要。“流式細胞術是這些應用的基礎,因為它使研究人員能夠快速、精確和可重複地確定細胞週期的不同階段,”美天旎流式細胞術儀器組組長 Pia Jeggle 博士說。“這種速度、可靠性和無處不在的可訪問性,再加上研究人員根據他們的特定需求定制實驗的靈活性,目前其他方法無法實現。”
DNA 含量分析僅提供有限的信息
細胞週期分析傳統上涉及使用碘化丙啶 (PI)、7-AAD、Hoechst 33342 和 DAPI 等染料對細胞 DNA 含量進行流式細胞術評估,以確定細胞週期每個階段的細胞比例。“這些染料以化學計量方式結合 DNA,因此 G1 期細胞的 DNA 量是 G2 期細胞的一半,這反映在測量的熒光中,”應用和流動試劑全球產品經理 Christopher Brampton 博士解釋說Bio-Rad 實驗室。
“然而,這種方法的一個缺點是它只能提供有限的信息。例如,僅使用 DNA 含量無法區分靜止/G0 細胞與 G1、區分 G2 和 M,或準確確定 S 期細胞的百分比。出於這個原因,研究人員通常將 DNA 含量分析與細胞週期標誌物的檢測結合起來,以更詳細地了解每個細胞中的細胞週期過程或途徑正在發生哪些變化。這對於針對細胞週期特定方面的藥物開發計劃特別有用。”
細胞週期標誌物提供更深入的見解
Luminex 流式細胞術檢測和應用總監 Kamala Tyagarajan 博士指出,監測胸苷類似物(如 BrdU)在新合成的 DNA 中的摻入,然後用抗 BrdU 抗體和 PI 進行檢測,是一種既定方法更好地梳理出 S 期的細胞。“其他流行的基於抗體的策略包括對核抗原 Ki67 進行染色,這是一種活躍循環增殖細胞的標誌物,被認為在 G0 期被降解;評估增殖細胞核抗原的水平以區分 S 期亞階段;並檢測磷酸化組蛋白 H3,它是 M 期的標誌物,”她說。“此外,分析細胞週期蛋白和細胞週期蛋白依賴性激酶的峰值表達以及 DNA 含量分析有助於表徵不同的細胞週期階段。”
作為對這些方法的補充,賽默飛世爾科技的 Invitrogen™ Click-iT™ Plus EdU 細胞增殖分析被開發為使用 BrdU 的非基於抗體的替代方法,從而避免了 DNA 變性的需要。“檢測 BrdU 需要使用酸、熱或核酸酶處理使 DNA 變性,這會引入不需要的偽影並延長檢測時間,”賽默飛世爾科技高級產品經理 Jolene A. Bradford 報告說。“相反,EdU 是通過點擊反應檢測的——一種在溫和條件下快速且選擇性地進行的反應,以共價連接特定分子成分,在這種情況下,EdU 和熒光團標記的吡啶甲酰疊氮化物用於直接測量 S 期細胞。”
Click-iT™ Plus EdU 細胞增殖檢測採用簡單、可靠的方案,並與大多數標準熒光團偶聯物兼容。
應對基於流式細胞術的細胞週期分析的挑戰
基於流式細胞術的細胞週期分析有其自身的挑戰。至關重要的是,雙峰和團塊的存在會干擾確定倍性並產生可靠的結果。“正確的樣品製備對於細胞週期分析至關重要,應包括旨在確保單細胞懸浮的步驟,”Jeggle 評論道。“通過避免過度劇烈的離心、向樣品中添加 DNase 以及使用不含鈣和鎂陽離子的重懸緩衝液,可以防止結塊。還建議將細胞通過細胞過濾器,同時排除雙峰和死細胞將有助於提高數據質量。”
進行更深入的細胞週期分析的研究人員面臨的另一個常見問題是它需要固定細胞,從而降低了其他下游應用的潛力。“細胞週期分析通常對固定在 -20 o C 的 70% 乙醇中的細胞進行,這可能會對您可能感興趣的其他染色劑和標記物產生不利影響,”Brampton 說。“Hoechst 是一個例外,因為它毒性低,容易穿過細胞膜與 DNA 結合,因此可用於活細胞分選。” 標記活細胞的另一種選擇是使用細胞可滲透的 DNA 染料,例如 Thermo Fisher Scientific 的 Invitrogen™ Vybrant™ DyeCycle™ 染料,它可以被一系列不同的激光激發,從而提高了多路復用的靈活性。
擴展細胞週期分析的範圍
為簡化細胞週期分析而開發的其他技術包括現有 DNA 染料的下一代版本,可減少處理步驟的數量以獲得更可重複的結果。例如,Bio-Rad 的 PureBlu™ Hoechst 33342無需稱重步驟,重懸後僅需一次稀釋,而ReadiDrop™ 碘化丙啶 可直接使用,只需與樣品孵育 20 分鐘。後者與 Click-iT™ Plus EdU 染色結合使用,在最近的一份出版物中被引用,其中研究人員在人類誘導的多能幹細胞中生成了 PAX7 報告線。在這項研究中,PAX7 +細胞被證明可以產生肌纖維並在體外自我更新o 和體內o,對治療肌營養不良症具有重要意義的發現。
儀器儀表的進步也有助於推動新發現。使用美天旎的 MACSQuant 流式細胞儀,將自動樣品標記與自動體積細胞計數相結合,研究人員發現 Myc通過激活 Cdk1 和 p27 磷酸化來刺激細胞週期進程;表明 CRK3在墨西哥利甚曼原蟲 的細胞週期中具有重要作用,表明它是治療利甚曼病的重要治療靶點,這種疾病每年導致約 40,000 人死亡;並證明癌症幹細胞樣細胞的化學抗性與細胞週期有關。
利用成像流式細胞術和人工智能 (AI) 等新技術的平台同樣也在促進研究人員對細胞週期的理解。例如,Luminex 的 Amnis ® ImageStream ®X和 Flow Sight ®成像流式細胞儀將核/細胞週期標誌物的熒光染色與形態數據結合起來,並通過 AI 進行進一步分析,以獲得有關不同細胞週期階段的更詳細信息。“這種方法保持了對大量細胞進行採樣的優勢,同時提供了更強大的集成數據,”Tyagarajan 解釋說。“隨著闡明細胞週期機制的努力繼續進行,成像流式細胞術和深度學習等方法將提供有關細胞週期階段的豐富信息,這對未來的突破至關重要。”