選擇測序技術的指南
在 DNA 測序方面,當今可用的三種主要技術可提供出色的結果——尤其是在您明智地選擇的情況下。這些方法——Sanger 測序、下一代測序 (NGS) 和長讀長測序——有很大的不同,新手測序人員應該了解哪種方法最適合他們的研究。以下是對這些方法、優缺點和重要標準的簡要回顧,可幫助您權衡下一個測序選擇。
選擇測序方法的標準
選擇測序方法的標準很多,取決於研究人員及其項目的性質。正在研究的生物學問題是關鍵。Pacific Biosciences 副總裁兼首席科學官 Jonas Korlach 說:“研究的背景決定了最好使用哪種類型的測序,因為不同的測序方法具有不同的特徵來推動選擇。”
最常見的標準包括測序時間、通量、成本和準確性——所有這些往往會相互影響。“準確性、成本和數據吞吐量之間的動態一直是測序技術選擇的驅動因素,”Illumina 首席技術官兼研究和產品開發主管 Alex Aravanis 說。“在不犧牲準確性的情況下,成本和通量的提高推動了 DNA 測序對廣泛的應用和用戶的可及性。”
成本將取決於是否需要購買儀器,或者您是否已經可以使用(在實驗室、部門或核心設施中);購買材料和試劑;樣本數量;以及您是否計劃外包任何測序或準備步驟。另一個值得考慮的因素是要測序的目標的大小(即整個基因組,或只有幾個基因),因為這會影響測序時間和成本。
作為一個考慮因素,排序時間包括項目完成的預期總時間,還包括動手時間與自動化時間。此外,考慮測序技術的吞吐量水平,它會影響項目的預期總時間。
測序過程中產生的讀取長度也可能會影響決策,因為某些應用需要更長的讀取長度(見下文)。NGS 產生最短的讀長(約 50-500 bp),其次是 Sanger 測序(約 500-1000 bp),然後是長讀長測序(約 5-30 kb)。“閱讀長度是一個考慮因素,即客戶將測序到回答生物學問題所需的長度,但不是更長,因為它會增加成本和時間,”Aravanis 說。
桑格測序
Sanger 測序是一項久經考驗的技術,對於少量樣本來說簡單快速,能夠解析單個鹼基對。它在摻入放射性標記的核苷酸類似物後通過鏈終止起作用。然後通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的 DNA 片段以進行鑑定。Sanger 方法對包含重複和二級結構的複雜 DNA 區域很有幫助,並且通常被用作驗證 NGS 檢測到的遺傳變異的正交方法。
但是,與 NGS 相比,Sanger 測序的通量較低,因此可能不適合大型項目。“Sanger 測序可對較小的 DNA 區域、一小組基因以及通常少於 1000 個樣本進行高度準確的測序,”賽默飛世爾科技 NGS 精準醫學計劃全球負責人 Jeffrey Smith 說。
事實上,對於較小範圍的項目,使用 Sanger 排序通常是最有意義的。“使用 Sanger 測序進行靶向或聚焦測序的項目時間、成本和復雜性要低得多,”賽默飛世爾科技毛細管電泳副總裁兼總經理 Kay Eron 說。毛細管電泳在毛細管電泳儀器上的毛細管內使用 Sanger 測序化學,有助於查明基因片段中的單個鹼基。
新一代測序
遺傳目標的大小將強烈影響測序方法的選擇。“雖然較小的 DNA 大小和少量基因更適合 Sanger 測序,但大面積的基因組或基因組和基因靶標最適合 NGS,”Eron 說。NGS 也稱為大規模並行測序,採用合成測序方法,在大規模並行方法中使用熒光標記的核苷酸。
與使用 Sanger 測序相比,NGS 的更高通量使大型項目更快、更容易、更便宜。“在對基因組或基因組等大區域進行測序時,NGS 的項目時間和成本會更低,”Eron 說。NGS 是全基因組測序、全外顯子組測序、分析大型基因組、檢測稀有變異以及發現和診斷的理想選擇。“使用 NGS 技術可以有效地完成掃描基因組大面積區域以檢測新突變或同時對一組基因進行測序的發現研究,”史密斯說。“Sanger 測序 [用於這些應用] 只會花費太長的時間,而且無論是美元還是組織成本都太高了。” NGS 所需的樣本輸入量較少,也使其成為分析稀有樣本的理想選擇。
NGS 的多學科實用性和可擴展性可能是一些研究人員的決策點。“NGS 在基因組學、轉錄組學和表觀遺傳學方面具有極其廣泛的適用性,能夠從基於小擴增子的實驗擴展到群體規模的全基因組測序項目,”Aravanis 說。然而,對於靶向測序(例如,一個或多個基因),NGS 可能比 Sanger 更昂貴。NGS 還需要使用更昂貴的 NGS 測序儀儀器。NGS 工作流程比 Sanger 測序更複雜,但越來越多地使用自動化正在減輕這種負擔。
長讀測序
在長讀長測序中,DNA 片段在穿過納米孔時單獨測序(Oxford Nanopore Technologies),或者在單個小孔中復制(Pacific Biosciences)。較長的重疊序列使組裝更容易,就像用更少的大塊拼圖拼圖,而不是 NGS 中更多的小塊。其他優點包括消除了擴增偏差,並且可以更容易地檢測到大插入/缺失、重複區域等特徵。長讀長測序的錯誤率可能高於 NGS,但持續的技術改進正在縮小準確性差距。
如果較短的測序讀數不足以回答您的生物學問題,長讀數測序是一個不錯的選擇。“提供長讀長(1 kb 或更長)的測序技術有助於基因組組裝和檢測稀有變異,”Smith 說。“由於需要更完整的基因組覆蓋和更好地了解整個染色體組織,這些應用程序適合這種方法。”
Pacific Biosciences 的 HiFi 測序使用其 SMRT 技術,確保需要全面了解人類基因組的基因組研究的高讀取準確性。“這揭示了更多的基因組區域,提供了重要的相位信息,並提供了全長 RNA 轉錄本分辨率,所有這些都是短讀長測序無法獲得的,”Korlach 說。“例如,在罕見病和遺傳病研究領域,研究人員使用 PacBio HiFi 測序來解決短讀長不足且無法提供答案的情況。” PacBio 正在與加州大學洛杉磯分校精準醫學研究所和大衛格芬醫學院以及拉迪兒童基因組醫學研究所合作,以幫助識別罕見的疾病變異。
有時研究人員可能需要使用兩種測序方法。“一小部分人類基因組特別難以閱讀,”Aravanis 說。“納米孔和單分子 [長讀長測序] 方法可以作為 Illumina SBS [NGS] 的補充方式,作為反射測試或正交驗證,或與 Illumina SBS 和其他從頭組裝和/或參考基因組。” 雖然這很不尋常,但很高興知道存在這種可能性,並且技術的進步使所有方法變得越來越方便和負擔得起。