流式細胞儀故障排除指南
與許多其他免疫測定技術相比,流式細胞術的一個主要優勢是它允許研究人員在個體基礎上研究細胞。然而,流式細胞術的複雜、多參數特性可能使解決任何問題變得困難,尤其是當樣品製備、面板設計和儀器設置都可能導致任何問題時。在這裡,我們匯總了一些常見的流式細胞儀投訴並提出了解決這些問題的建議方法。儘管這絕不是一份詳盡的清單,但我們希望它可以作為您的流式細胞術實驗故障排除的有用參考。
樣品製備技術是流式細胞術成功的基礎
典型的流式細胞術實驗從樣品製備開始,必須仔細考慮以避免影響結果。“理想情況下,樣品應在收集後儘快處理,以幫助將細胞保存在自然狀態並保持高活力,”美天旎流式細胞儀全球產品經理 Pia Jeggle 博士指出。 “在收集後 48 小時內對材料進行分析的情況下,建議將樣品保存在 4°C 的專門細胞或組織儲存溶液中而不是冷凍。但是,在無法避免冷凍的情況下,例如從大型隊列研究中收集材料或在手術過程中——應嚴格優化方法以防止不良影響,例如細胞死亡、細胞組成改變或應激基因的誘導。”
至關重要的是,樣品製備方法應始終針對感興趣的細胞類型進行定制;例如,從腦組織中分離脆弱的神經元需要一種與從血液中分離免疫細胞的方法截然不同的方法。
控制提供對數據質量的重要洞察
對照對於展示可靠的測定性能和驗證實驗數據至關重要。但是,除了任何生物測定所需的通常的陽性和陰性對照外,精心設計的流式細胞術實驗還應包括幾個特定於應用的示例。“未染色的對照將有助於在儀器設置期間確定光散射和熒光參數,”Bio-Rad 流式細胞術試劑產品經理 Mike Blundell 解釋說。“這些應輔以活力控制以排除死細胞,死細胞非特異性結合抗體並具有更高的自發熒光,以及通過控制來保護多色面板的性能。” 後者的例子包括單染色補償控制,這對於從相鄰通道中去除重疊熒光至關重要,以及用於門設置的熒光減一控制。“如果你有良好的控制,只識別十個細胞就可以代表一個重要的結果,”布倫德爾說。“相比之下,使用糟糕的控制可能意味著從數千個細胞中收集的數據毫無意義。”
故障排除提示
儘管流式細胞術與其他免疫分析技術不同,但它所呈現的問題類型通常可以使用久經考驗且值得信賴的方法來解決。例如,減少高背景信號的一種方法是嘗試增加協議清洗步驟的數量。如果問題是特定於應用的,旨在優化面板設計或更改儀器設置的解決方案可能更有效。下表列出了一些常見的流式細胞儀投訴並提出了解決方法。
熒光強度太高
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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封鎖不足 | 切換到使用不同的封閉試劑
增加阻塞步驟的持續時間 |
抗體濃度過高 | 滴定抗體試劑以確定最佳濃度
包括陽性和陰性(未染色)對照以驗證抗體性能 |
洗滌不充分 | 增加洗滌步驟的數量
在洗滌緩衝液中加入 Tween-20 或 Triton-X,以確保未結合的抗體不會被困在細胞內 |
明亮的熒光團已被用於檢測豐富的抗原 | 始終將暗淡的熒光團與豐富的抗原配對,反之亦然 |
激光功率太高 | 降低激光功率(在儀器允許的情況下)以降低信號強度 |
PMT 電壓太高/信號超出範圍 | 確認在採集之前已加載正確的儀器設置
包括合適的控制以優化每個熒光團的儀器設置 使用上述控件執行電壓滴定,以確定檢測器的最佳設置 |
增益太高 | 確保使用適當的陽性對照進行儀器設置
降低增益以降低信號強度 |
熒光強度弱或無信號
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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過度固定 | 嘗試使用不同的固定劑或減少固定時間/濃度 |
抗體對靶標的親和力較差 | 確認抗體試劑經過驗證可檢測所選樣本類型和物種中的目標,並且與固定方法兼容(如果適用)
檢查抗體是否經過流式細胞術驗證 改用具有替代表位的抗體 |
抗體濃度過低 | 滴定抗體試劑以確定最佳濃度
增加抗體孵育步驟的持續時間 包括陽性和陰性(未染色)對照以驗證抗體性能 |
熒光團已褪色/串聯染料已分解 | 用新鮮試劑替換熒光團偶聯抗體,並遵循製造商的使用說明
將熒光團和染色樣品避光存放 避免使用串聯染料進行長時間進行的實驗 |
靶抗原稀缺 | 參考文獻以確認所選細胞類型表達抗原並確定是否需要某種形式的治療來增強表達
盡可能使用新鮮分離的細胞,避免凍融 始終將明亮的熒光團與稀缺的抗原配對,反之亦然 考慮進行細胞富集(例如,通過磁激活細胞分選/MACS) |
抗體無法接近細胞內抗原 | 優化用於細胞透化的方法
通過使用蛋白質轉運抑製劑(如布雷非菌素 A)防止細胞內分析物被分泌 在冰上執行所有協議步驟,以避免細胞表面抗原內化 選擇用於檢測細胞內靶標的低分子量熒光團 |
熒光團與儀器激光器和檢測器不兼容 | 檢查熒光團的激發和發射特性是否與流式細胞儀的激光器和檢測器兼容 |
事件率太高/信號被中止 | 將細胞群調整到適當的密度(通常建議使用1 x 10 6 個細胞/mL) |
信號未正確補償 | 檢查補償控制是否設置正確以捕獲所有事件
確認門控正確(即負門內的細胞為陰性,正門內的細胞為陽性) 如果您的信號較弱,請考慮使用補償磁珠以確保良好的補償 |
激光未對齊 | 使用校準珠檢查激光對準 |
增益太低或閾值太高 | 確保使用適當的陽性對照進行儀器設置
調整閾值以確保熒光信號不被切斷 增加增益以增加信號強度 |
高背景
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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封鎖不足 | 切換到使用不同的封閉試劑
增加阻塞步驟的持續時間 考慮使用沒有 Fc 受體阻斷要求的抗體(例如 REAfinity™ 抗體) |
抗體濃度過高 | 滴定抗體試劑以確定最佳濃度
包括陽性和陰性(未染色)對照以驗證抗體性能 |
洗滌不充分 | 增加洗滌步驟的數量
在洗滌緩衝液中加入 Tween-20 或 Triton-X,以確保未結合的抗體不會被困在細胞內 |
檢測到非特異性細胞 | 包括同種型對照以排除與 Fc 受體、熒光團或其他細胞成分結合的非特異性抗體
加入 Fc 封閉步驟 考慮使用沒有 Fc 受體阻斷要求的抗體(例如 REAfinity™抗體) |
存在死細胞、聚集體或碎片 | 在獲取之前將細胞通過細胞過濾器以去除任何團塊
將細胞置於 4 o C 或冰上 包括活性染料,例如碘化丙啶 (PI) 或 7-AAD,以排除死細胞 盡可能使用新鮮分離的細胞,避免凍融 重懸時,使用不含 Ca 2+ /Mg 2+且蛋白質含量高達 2%的緩衝液 考慮將 DNase 添加到樣本中 |
自發熒光 | 避免過度固定
包括未染色的對照以確定背景自發熒光水平 將具有天然高自發熒光的細胞(例如,嗜中性粒細胞)與明亮的熒光團或在紅色通道中發射的熒光團(例如,APC)配對 |
不尋常的散射輪廓
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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細胞被污染 | 使用無菌細胞培養技術
妥善存放試劑和染色細胞以防止細菌生長 始終使用新鮮的緩衝液(例如,用於封閉和洗滌) 清洗樣品管線以確保儀器沒有被之前的樣品污染 |
細胞受損 | 優化樣品製備
避免劇烈的渦旋或離心,或凍融循環 採集前不要長時間儲存染色的細胞 |
大量死細胞 | 包括活性染料,例如碘化丙啶 (PI) 或 7-AAD,以排除死細胞
盡可能使用新鮮分離的細胞,避免凍融 考慮使用死細胞去除試劑 |
血漿或血清樣本中存在紅細胞 (RBC) | 通過在顯微鏡下檢查樣本來確認 RBC 裂解已完成
準備新鮮的 RBC 裂解緩衝液 在 RBC 去除過程中增加洗滌步驟的數量 |
激活方法改變了細胞特性 | 檢查文獻以確保使用了正確的激活方法並且沒有發生意外激活 |
異常事件率
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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細胞數量太高/太低 | 仔細檢查細胞計數(通常建議使用1 x 10 6 個細胞/mL)
考慮使用自動細胞計數器而不是血細胞計數器進行計數 輕輕吹打懸浮液,確保細胞充分混合 |
存在死細胞、聚集體或碎片 | 在獲取之前將細胞通過細胞過濾器以去除任何團塊
將細胞置於 4 o C 或冰上 包括活性染料,例如碘化丙啶 (PI) 或 7-AAD,以排除死細胞 盡可能使用新鮮分離的細胞,避免凍融 重懸時,使用不含 Ca 2+ /Mg 2+且蛋白質含量高達 2%的緩衝液 考慮將 DNase 添加到樣本中 |
進樣管堵塞 | 按照製造商的說明疏通流式細胞儀 |
系統已引入空氣 | 請參閱製造商的說明 |
在應該只有一個或沒有的地方觀察到多個細胞群
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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多種細胞類型表達目標 | 有關目標表達的信息,請參閱文獻
調整染色策略以消除分析中不需要的細胞類型 |
存在死細胞、聚集體或碎片 | 在獲取之前將細胞通過細胞過濾器以去除任何團塊
將細胞置於 4 o C 或冰上 包括活性染料,例如碘化丙啶 (PI) 或 7-AAD,以排除死細胞 盡可能使用新鮮分離的細胞,避免凍融 重懸時,使用不含 Ca 2+ /Mg 2+且蛋白質含量高達 2%的緩衝液 考慮將 DNase 添加到樣本中 |
熒光信號補償不足 | 對照的熒光強度需要與其專用通道中的樣品染色一樣高或更高
在軟件程序中使用自動補償功能而不是手動補償 避免使用目視校準,如果需要手動調整,請使用平均熒光強度 (MFI) 校準 |