成功冷凍保存的建議
冷凍保存是保存用於分子和細胞生物學和治療學的重要細胞的重要工具。如果不注意細節,冷凍保存過程會撕裂細胞,字面意思是——細胞內形成的鋒利冰晶可以撕裂質膜。但是,通過認真遵守最佳實踐,成功的冷凍保存方案可以最大限度地減少這種損害,並在解凍過程中相對毫髮無損地引導您的細胞。以下是一些專家建議,可幫助您保存寶貴的細胞以供未來實驗使用。
從健康細胞開始
經常重複的建議值得再次重申:從最健康的細胞開始。“在冷凍之前,細胞應該具有超過 90% 的高存活率,並且應該沒有支原體污染,”CLS 細胞系服務項目經理 Jonathan Steubing 說。
即使是健康的培養物,在解凍過程中也會因細胞死亡而損失。康寧生命科學科學支持專家 Xiaoyu (Sherwin) Zhu 建議使用 90% 匯合度的細胞培養物,使用最低細胞密度為 10 6細胞/mL,並在冷凍前 24 小時更換培養基。“此外,在冷凍保存之前,您應該仔細檢查培養物中是否有任何污染,”他說。“例如,細胞可以在不含抗生素的培養基中培養幾代,這樣可以有時間輕鬆檢測到任何隱藏的、抗藥性的污染物。”
凍結媒體
冷凍介質中的關鍵成分之一是冷凍保護劑 (CPA),它可以在溫度下降時保護細胞免受冰晶的侵害。對於研究應用,二甲基亞砜 (DMSO) 是一種常見的 CPA,用量為 5–20%,與蛋白質(如人血清白蛋白)一起使用。Cytiva 的冷凍生物學家 Julie Meneghel 說:“必須仔細考慮 CPA 及其濃度的選擇,因為根據細胞類型,每種 CPA 都會具有不同程度的細胞毒性。” “CPA 在解凍狀態下與生物材料的接觸時間應該受到限制,無論是預凍還是解凍後。”
“胎牛血清也用於冷凍保存——95% 的血清和 5% 的 DMSO 是一些敏感細胞系,尤其是雜交瘤的好方法,”朱說。“某些細胞類型對 DMSO 敏感,因此我們使用 5–20% (v/v) 甘油作為替代。”
用於治療細胞的 CPA 更加有限,因為它們將被注入人體。“對於治療用途,通常避免使用血清,並且 DMSO 的量是有限的,”梅內格爾說。“這是通過以更高的細胞密度進行冷凍保存或通過降低 DMSO 的濃度來實現的。”
冷凍過程
“細胞外冰是不可避免的,但細胞內冰可能非常具有破壞性,”梅內格爾說。避免細胞內結冰造成的損害意味著緩慢而穩定地冷卻細胞。這允許在培養基中形成冰,從而引發水和溶質的重要洗牌:細胞外的滲透壓增加導致水離開細胞。
這種部分脫水對於成功冷凍保存至關重要,因為這意味著細胞內條件不利於冰晶的形成。“然而,如果冷卻太快,細胞將沒有時間脫水,細胞內的冰結晶就會在熱力學上變得有利,”梅內格爾說。“在冷卻時遇到這種情況的細胞在解凍後將無法存活;如果有疑問,出於這個原因,通常更慢地冷卻比更快地冷卻更好。” Steubing 推薦標準的、常用的冷卻速率約為 1°C/min。“通常,我們添加冷凍培養基並將細胞置於 -20°C 下 40 分鐘,將細胞在 -80°C 下儲存過夜,然後將細胞轉移到液氮中,”他說。
儘管用於研究或治療用途的細胞的冷凍保存是相似的,但在處理治療細胞(通常是原代細胞、幹細胞或淋巴細胞)時,需要牢記一些重要的區別。“這些細胞對溫度變化更敏感,並且在冷凍保存過程中往往會失去活力,”康寧生命科學科學支持經理 Kyung-A (Katie) Song 說。“為了保護活細胞,我們經常使用包含人或牛血清白蛋白和其他因子的 CPA 配方,並以更高密度的細胞冷凍以用於研究應用。”
解凍過程
“請記住,’快速解凍,緩慢凍結’,”宋說。“快速冷卻會降低細胞活力,或導致細胞死亡。” 快速解凍細胞並去除或稀釋 CPA 是最重要的。從氣相液氮中取出冷凍管後,立即將其放入 37°C 水浴/裝置中。“快速解凍為大多數細胞培養物提供最佳恢復,因為它減少了或防止在再水化過程中在細胞內形成破壞性冰晶,”宋說。
Steubing 建議事先準備無菌材料和培養基,將細胞培養基保持在室溫。“一旦細胞解凍,就可以快速工作,”他說。“在無菌罩下開始工作之前,一定要在冷凍管中留一小塊冰塊。” 因為 CPA 在解凍時會變得有毒,所以不要讓樣品升溫到浴槽/設備的溫度。
下一個重要步驟是快速去除或稀釋 CPA,以免它們傷害您的細胞。“在細胞療法中尤其如此,在這種療法中,通常在輸注前加熱含有 CPA 的樣品,”Meneghel 說。“這種升溫不是出於低溫生物學原因——我們更希望樣本保持低溫——而是將冷輸注到患者體內可能會很痛苦。”
因為冷凍培養基通常含有高濃度的血清和冷凍保護劑,所以解凍意味著將您的細胞轉移到含有較少兩者的培養基中。“將細胞非常緩慢地轉移到含有預熱培養基的 15 mL 錐形管中非常重要,因為細胞將從高濃度培養基轉移到低濃度培養基,”Song 指出。
遵循這些冷凍保存指南將有助於確保重要的細胞系或治療性細胞樣本在需要前保持安全,並在解凍以備將來使用時保持健康。