細胞系認證的重要性
細胞系認證是驗證實驗中使用的細胞身份的過程。它通常包括確認細胞係來自正確的物種和供體,並且它們是無污染的。在本文中,我們回顧了為什麼細胞系驗證很重要,並回顧了一些可用的方法。
使用未經驗證的細胞系會產生重大問題
ICLAC 錯誤識別細胞系登記冊的最新版本,今年早些時候發布,列出了令人震驚的 576 個細胞係被錯誤識別。其中,531 種沒有已知的真實庫存,73 種與原始供體不相符,67 種來自不同的物種,而海拉是已鑑定的 144 種不同污染物中最常見的污染物。Promega 高級應用科學家 Leta Steffen 評論道:“至少,使用錯誤識別或受污染的細胞系的科學家將浪費寶貴的時間和資源進行實驗,直到錯誤被發現為止。” “如果錯誤未被發現,由此產生的數據可能會導致錯誤的理論,破壞科學進步並危及聲譽和未來的資金。” ICLAC 記錄了幾個關於細胞系錯誤識別的案例研究,包括對標題或摘要中提及 Chang 肝細胞的出版物的分析;現在已知這些細胞是 HeLa 衍生物,不適合作為正常肝臟的模型,在研究界引起重大反響。
表型漂移是一面紅旗
“表型漂移通常是細胞存在某種類型問題的一個很好的指標,”ATCC 首席科學家方田博士報告說。“這可能是由於細胞繼代培養不一致或與細胞接種密度過高或過低相關的壓力造成的,並且由於腫瘤異質性,在由亞克隆細胞群組成的培養物中尤為常見。然而,表型漂移更有可能是由污染引起的,污染可能是通過常規細胞培養甚至在細胞系建立過程中意外引入的。”
Crown Bioscience 系統生物學執行董事盛果博士補充說,表型漂移有時可以追溯到遺傳漂移,尤其是在使用藥物治療選擇性富集具有某些基因突變或其他特徵的細胞的情況下。“根據我們的經驗,表型漂移最常由細胞系錯誤標記或污染引起,”他說。
STR 分析是當前細胞系鑑定的金標準
2011 年,一個專家委員會發布了 ANSI/ATCC ASN-0002-2011 共識指南,用於基於短串聯重複 (STR) 分析的細胞系鑑定最佳實踐;今年早些時候發布了修訂版 (ANSI/ATCC ASN-0002-2021)。STR 是 DNA 的短 (2–7bp) 重複序列,可提供個體的遺傳指紋;對於細胞系認證,它們允許研究人員驗證人類細胞係是否與原始供體匹配,或者是否發生了與另一個人類細胞系的交叉污染。
“STR 分析的一個主要優勢是它具有高度的可重複性,”Tian 解釋說。“結果在不同實驗室以及在不同時間測試的細胞系的不同傳代中具有可比性。STR 分析還具有極高的辨別力,並且由於它是一項成熟的技術,因此可以輕鬆地將結果與龐大的數據庫進行比較,以快速準確地驗證細胞系的身份。” STR 分析的這些特徵使其成為細胞系鑑定的黃金標準方法,儘管該技術的一個缺點是其鑑定非人類細胞系的能力有限。為了解決這個限制,
STR 分析可以外包或在內部運行
“大多數商業 STR 化學物質都可以作為多重分析進行,並使用多個染料通道進行電泳,”Steffen 指出。“這允許同時分析許多 STR 基因座,提供來自不同供體的細胞系之間的敏感區分。” Promega 的 GenePrint ® 10 和 GenePrint ®24 系統能夠分別分析 10 和 24 STR 位點,並被核心設施廣泛用於按服務收費的細胞系認證。此外,Promega 還為有興趣在內部進行細胞系鑑定的研究人員開發了 Spectrum Compact CE 系統。“Spectrum Compact CE 系統使研究人員能夠使用毛細管電泳進行片段分析(包括細胞系鑑定)和 Sanger 測序,”Steffen 說。“在不到一天的時間內,就可以從培養的細胞中純化 DNA,使用 GenePrint ® 24等多重 STR 化學進行 PCR ,在 Spectrum Compact CE 系統上對 PCR 產物進行電泳,然後將得到的圖譜與高質量的數據庫——例如 ATCC STR 數據庫——或源細胞的配置文件。”
基於 NGS 的 SNP 分析
單核苷酸多態性 (SNP) 是天然存在的變體,與 STR 一樣,可用於細胞系鑑定。至關重要的是,通過提供對單個 DNA 核苷酸水平變異的洞察,SNP 能夠檢測物種內污染物並驗證物種特異性腫瘤模型——這兩種分析都無法以足夠高的分辨率進行。
“從歷史上看,由於繁瑣的工作流程和並行監測多個 SNP 的複雜性,SNP 分析僅限於處理少量樣本,”郭報告說。“然而,隨著新一代測序 (NGS) 的出現,現在可以實現更高的準確性、靈敏度和通量,以獲得更詳細的研究細胞系概況。” 在現有的各種 NGS 技術中,Crown Bioscience 選擇使用條碼深度 NGS 進行細胞系鑑定(一種使用多重 PCR 擴增數百個目標 DNA 區域,以便同時對數百個樣本進行高深度測序的方法)。“通過這種方法,我們能夠以 100% 的準確率識別人類和小鼠樣本,”郭說。“我們還可以識別污染物並確定污染比率,以及能夠估計三個或更多細胞系的混合比率。隨著類器官、同種移植模型和異種移植模型經常用於科學研究,驗證這些異質系統變得比以往任何時候都更加重要。”
桌子。STR 分析和基於 NGS 的 SNP 分析的比較。表由 Crown Bioscience 提供。
最佳實踐對於獲得可靠結果至關重要
為使基於細胞的數據可信,建議研究人員遵循 ICLAC 建立並在 ANSI/ATCC ASN-0002-2011 和 ANSI/ATCC ASN-0002-2021 共識指南中定義的細胞系驗證最佳實踐。Steffen 強調應始終從高質量來源獲得細胞系,並建議在使用前根據ICLAC錯誤識別細胞系登記冊和常見細胞數據庫(如ICLAC.org、Cellosaurus或 COSMIC)檢查細胞系名稱。
“無論何時獲得或建立細胞系,無論何時進行大型銀行,都應該進行細胞系鑑定,並且在每項研究中都應定期進行,”田補充道。“此外,每當觀察到新的表型時,細胞系認證就至關重要。” 最後,郭強調了在每個細胞系的整個生命週期中保持完整記錄的價值,包括細胞的儲存、傳代和分佈。“確保您擁有正確的細胞係並且它沒有受到污染,可以避免可能導致錯誤結論的不可靠的研究結果;浪費時間、精力和金錢;並損害了聲譽,”他警告說。