RNA測序的決策
許多實驗室越來越多地使用 RNA 測序來了解細胞內發生的轉錄組變化。然而,首先了解如何正確執行這些測序實驗很重要,因為它們往往是昂貴的、勞動密集型的,並且需要一些培訓和技能才能正確完成。
確定測序類型
在開始 RNA 測序實驗之前要問的第一個問題是,“需要什麼類型的測序來回答手頭的生物學問題?” 批量 RNA 測序測量整個組織樣本的平均基因表達水平。使用單細胞 RNA 測序 (scRNASeq),可以在細胞水平上測量基因表達。從每種技術中獲得的時間、成本、工作量和詳細程度都需要權衡。“批量測序對於比較轉錄組學和生物標誌物研究很有用,但它無法捕捉組織的異質性,”哈佛大學治療科學研究所助理研究員兼哈佛大學單細胞核心主任 Mandovi Chatterjee 博士說醫學院。“複雜組織樣本中的組成細胞類型及其豐度只能使用 scRNASeq 進行分析。” 因此,scRNASeq 可用於研究特定細胞群中基因表達的變異性、時間進程研究、發育研究或譜系追踪。
如果樣本具有高度的細胞異質性,scRNASeq 可以更好地了解觀察到的變化。以色列魏茨曼科學研究所免疫學系 Ido Amit 博士實驗室的研究生 Yonatan Katzenelenbogen 正在使用 scRNASeq 進行免疫學研究。根據 Yonatan 的說法,細胞框架取決於細胞類型和細胞狀態。“不同細胞類型內的細胞狀態可用於回答有趣的生物學問題,而批量測序會丟失一些這種複雜性。” 然而,scRNASeq 比批量測序更昂貴且靈敏度更低。如果有細胞表面標記來幫助分類和選擇樣本中的不同細胞群,則可能不需要 scRNASeq。
選擇合適的平台
如果使用 scRNASeq,問題就變成了使用什麼平台。scRNASeq 有不同的平台可供使用,其中測序可以在孔(CEL-Seq、MARS-Seq、SMART-Seq、SCRB-Seq、Quartz-Seq)、納米/微孔(Seq-well)或液滴中進行( InDrops、DropSeq)。一些平台適合高通量分析,而另一些平台更適合低通量使用。對於任何平台,吞吐量和靈敏度之間始終存在權衡。通量是指可以分析的細胞數量,而靈敏度是指可以檢測到的 RNA 分子的數量。吞吐量越高,靈敏度越低。平台的選擇還取決於樣本類型和實驗需要。“高通量測序有利於觀察組織中的整體異質性或檢測罕見的細胞亞群,這需要分析大量細胞/樣本,”查特吉說。但是,當樣本量有限時,無法進行高通量測序。對於需要全長轉錄本的研究,高通量測序也不理想。
選擇和優化協議
每個 scRNASeq 工作流程都包括樣品製備、條形碼、文庫生成、測序,最後是數據分析。樣品製備涉及將樣品組織解離為細胞懸液,以便對細胞進行分選、裂解和條形碼化。“樣品製備無疑是獲得高質量數據的關鍵步驟,”Chatterjee 說。“高質量的樣本是 scRNASeq 的先決條件。” 它需要最少的碎片和無團塊的單細胞懸浮液。理想情況下,細胞的存活率應超過 90%,並且細胞膜的完整性應保持到封裝為止。Chatterjee 說:“細胞應該一直活著,直到它們被編入條形碼。” “雖然我們確實運行樣本,即使活力很低,來自裂解細胞的自由漂浮的 RNA 會導致更高的背景噪音,
奧地利科學院分子醫學研究中心 Christoph Bock 博士實驗室的高級博士後 Thomas Krausgruber 博士使用批量和 scRNASeq 研究結構免疫。他從皮膚、肺、肝臟和大腦等 12 種不同器官中分離出結構細胞(內皮、上皮和成纖維細胞),並使用基於流式細胞術的細胞分選法對其進行純化。“我們必須優化我們的分離方案,以確保我們從每個器官中獲得高質量和高活力的樣本用於我們的實驗,”他說。這使他能夠揭示結構細胞的器官特異性免疫適應以及結構細胞和免疫細胞之間複雜的相互作用。
Katzenelenbogen 同意一些解離方案傾向於富集或耗盡某些難以衡量的細胞群。“當我們開始一個新項目時,我們會比較各種解離方案,看看哪一種能夠為我們提供保持細胞異質性的最佳結果。” 有許多很好的在線資源可以提供有關組織特異性方案的信息,並且在測序前後進行良好的質量控制測試也有幫助。
在運行 scRNASeq 實驗時,批次效應可能是一個巨大的挑戰,並且在處理患者樣本以及進行時程或擾動研究時通常是不可避免的。由於多種原因,可能會出現批量效應。它們可能來自操作員、樣品製備、不同批次的試劑、動物、不同的文庫製備時間、不同的測序運行等等。通過使用相同的操作員、相同的試劑組、一起準備文庫和測序、通過條形碼(hastagging、MULTI-seq)合併樣本以及使用生物重複,可以最大限度地減少其中一些問題。“當單個樣本包含足夠的內部複雜性來識別轉錄變異的共享來源時,批量效應校正效果最好,”Chatterjee 說。
設計實驗時需要解決的其他重要問題之一是,“需要分析多少個細胞以及需要測序多深?” “經驗法則是,您需要 50-100 個具有獨特轉錄組特徵的細胞才能在 t-SNE 圖中形成一個獨特的簇,”Chatterjee 說。細胞群越稀有,要分析的細胞數量就越多,測序的深度也就越深。測序深度越高,成本越高。“有一個很好的平衡可以實現,”查特吉說。“因此,人們有時以較淺的測序深度開始他們的實驗,然後查看數據來決定要深入多遠。”
最後,重要的是要考慮資金和資源限制,以確定要投資的平台以及要運行的樣本數量。“每個實驗都需要一些個性化的關注,”查特吉說。“對別人有用的東西不一定適合你。”
如何獲得用於測序的優質樣品
- 盡可能縮短樣品製備時間
- 在樣品製備過程中保持低溫
- 優化最適合所用細胞類型的解離方案
- 盡可能保持裂解條件溫和
- 使用較短的協議時間和較大的噴嘴進行細胞分選
- 減少離心和重懸的時間
- 通過過濾或密度介質分離去除碎屑
- 在最終緩衝液中加入 BSA(最多 1%)或 FBS(最多 2%)
- 始終運行試點實驗以確保一切按預期進行