qPCR 和 dPCR:優勢和最佳用途
使用 PCR 擴增 DNA 是當今實驗室的一項基礎技術,創新不斷將其應用範圍從研究實驗室擴展到臨床。定量 PCR (qPCR) 允許對靶 DNA 進行相對定量,並提供一種可靠、成熟的測試特定序列是否存在的方法(例如,大多數基於 PCR 的冠狀病毒測試使用 qPCR)。PCR 的另一種形式,數字 PCR (dPCR) 或液滴數字 PCR (ddPCR),使用類似的化學方法檢測 DNA 序列,但在許多微小體積或液滴中進行檢測,利用數學的力量提高信噪比。
qPCR 和 dPCR 有很多相似之處和不同之處,但在與 PCR 專家交談時,有幾個重要的品質更加突出。這可能會隨著時間的推移而改變,因為 PCR 技術在不斷發展。本文討論了當今 qPCR 和 dPCR 技術的優勢和最佳用途之間的一些重要區別。
靈敏度,以及絕對與相對定量
多年來,定量 PCR 一直是許多應用的黃金標準。然而,dPCR 能夠提供更靈敏的測量和目標 DNA 的絕對定量(相對於 qPCR 的相對定量)。“使用 qPCR,科學家只能通過將結果與標準曲線進行比較來確定樣品中的核酸濃度,”Bio-Rad 實驗室數字生物學集團生物製藥部門經理 Marwan Alsarraj 解釋說。“另一方面,ddPCR 直接量化核酸,使工具更準確,因此對小核酸濃度更敏感。”
這使得 dPCR 非常適合目標存在於復雜樣本中的應用,例如分析來自液體活檢的循環腫瘤 DNA。“隨著目標分子變得越來越稀有,檢測和精確量化這些分子變得越來越具有挑戰性,”賽默飛世爾科技 dPCR 高級總監兼總經理 Paul Hung 說。“由於 dPCR 自然稀釋了許多反應中的分子,因此當給定目標存在於高濃度的非目標分子中時,可以提高靈敏度。” Thermo Fisher 最近推出了 Applied Biosystems QuantStudio Absolute Q 數字 PCR 系統,這是一款無需手動操作的 dPCR 儀器,具有類似 qPCR 的工作流程和 2 小時的運行時間。
在實驗室和診所中越來越多地使用 dPCR
研究實驗室和診所都受益於 dPCR 靈敏度的提高。“隨著細胞和基因治療研究和開發的不斷發展,開發人員越來越多地轉向 dPCR 來精確測量不同的目標,包括工程病毒載體、基因編輯事件、質粒和完整衣殼,”Hung 說。
腫瘤學和器官移植等臨床領域也受益於 dPCR 檢測稀有 DNA 的能力,以及量化稀有 DNA 中微小但顯著的倍數變化。例如,dPCR 用於檢測癌症患者的循環腫瘤 DNA,並評估細胞和基因治療的正確劑量。“隨著精準醫學變得越來越主流,我們預計 ddPCR 將在臨床中變得更加普遍,[因為] ddPCR 可以檢測腫瘤負荷響應癌症治療的微小變化,”Alsarraj 說。“例如,使用 ddPCR 進行連續監測可以使腫瘤學家識別治療後有復發風險的患者。”
動態範圍和靈活性
儘管 dPCR 可能在靈敏度方面表現出色,但 qPCR 仍然是許多其他應用的最佳選擇。“我們建議我們的客戶在基因表達中使用 qPCR,因為它的動態範圍很廣;其量化不同表達水平、區分剪接變體和多重分析的能力;及其高通量應用和自動化的能力,”Alsarraj 說。事實上,它在實驗室和監管環境中更為人所知,並廣泛用於基因、健康狀況或傳染病的篩查。
在分析大量樣本時,使用 qPCR 也可能比 dPCR 便宜。“qPCR 本質上是一種靈活且具有成本效益的技術,可滿足許多研究需求,使研究人員能夠選擇適合其特定需求的耗材,包括多種反應化學、分析選項和易於互換的塑料,”Hung 說。“在生物製藥行業,qPCR 用於單克隆抗體、疫苗、細胞和基因治療的製造過程,以及生物仿製藥作為質量控制和基因分析的工具。”
隨著不斷的創新和廣泛的使用,qPCR 的應用只會擴大。“科學家們不斷發現使用 qPCR 的新方法,因為它已經從基因表達擴展到製造和診斷的過程測試,”Alsarraj 說。“我們希望隨著技術核心應用的成熟,創新將繼續下去。”
多路復用的進展
儘管 qPCR 曾經在多路復用方面具有優勢,但如今已不那麼正確了。數字 PCR 正在迅速發展更高的多重功能——例如,Stilla Technologies 的 naica ®系統等平台可以運行 30 重或更多的 dPCR 反應。“一些客戶可以在 naica ®系統上運行與在 qPCR 儀器上相同的分析,但他們只運行一次樣品並獲得絕對定量,而不是依賴標準曲線並不得不重複運行他們的樣品,”說Stilla Technologies 全球營銷和商業運營副總裁 Matthew Grow。“在 naica ®上進行數字 PCR系統為研究人員提供了查看擴增和檢測效率的能力,一直到單個液滴的水平,每個 PCR 反應在他們珍貴的樣本中並行發生。”
隨著 dPCR 能夠檢測稀有基因表達或癌症相關的拷貝數變異事件,更多的多路復用可能會揭示更多未來使用的途徑。“多路復用 dPCR [是] 對當前下一代測序技術的出色診斷補充,可以讓醫院實驗室有機會進行更多的內部患者檢測,而不必與外包或集中式實驗室合作,”Grow 指出。
qPCR 和 dPCR 可能會繼續以互補關係存在。“我們已經看到 qPCR 對於監測和管理 COVID-19 大流行的重要性,它將仍然是臨床測試實驗室、分析開發人員和生物技術行業的重要工具,”Hung 說。“隨著 dPCR 技術通過簡化的工作流程和更快的回答時間變得更容易獲得,它將在需要穩健、可靠和精確量化的用例中得到採用。”
文章作者-Caitlin Smith
Caitlin Smith 擁有里德學院的生物學學士學位和博士學位。在耶魯大學獲得神經科學博士學位,並在 Vollum 研究所完成博士後工作。