生物標誌物發現的多路復用工作流程
生物標誌物是正常生物過程、疾病發病機制和患者對治療反應的重要指標。然而,發現新的臨床相關生物標誌物就像大海撈針,凸顯了多重方法的價值。本文描述了尋找新型生物標誌物的一些挑戰,並為優化多重工作流程以增加生物標誌物發現的可能性提供了建議。
生物標誌物發現的挑戰
根據 CANDOR Bioscience 的聯合創始人兼董事總經理 Tobias Polifke 博士的說法,生物標誌物發現的一個基本挑戰是真正的開關靶點很少見。“在疾病的情況下,很少有生物標誌物存在或不存在的情況,”他報告說。“相反,一種生物標誌物可能表現出濃度的增加或減少,或者其濃度可能與另一種生物標誌物有關。在篩選環境中識別生物標誌物需要一種具有足夠準確度和精確度的分析,以可靠地檢測此類變化,同時解決患者樣本材料中許多生物分子的固有不穩定性。”
RayBiotech Life 營銷和技術支持總監 Valerie Jones 博士指出,生物標誌物發現的另一個挑戰是分析足夠的樣本和對照以生成統計數據。“很多時候,潛在的生物標誌物是使用很少的樣本來確定的,而沒有採用獨立樣本隊列的後續研究,”她說。“在這些情況下,過度擬合數據是一個主要問題。” 發現新的生物標誌物可能還因可用樣本量而變得複雜,這會限制可以進行的分析的類型和數量,以及樣本材料中存在的蛋白質濃度範圍廣泛,可能跨越 10 個數量級。
可訪問性是一個關鍵考慮因素
生物標誌物的可及性至關重要,無論是在發現期間還是之後。Owlstone Medical 的首席生物標誌物科學家 Jason Kinchen 博士解釋說,雖然最相關的生物標誌物通常是最直接的、侵入性樣本收集方法,例如組織活檢,但通常遠非理想。“在危及生命的情況下,組織活檢可能是可以接受的,”他說。“然而,這不太可能適用於早期檢測,因為通常需要篩查無症狀患者。使用血液、尿液或呼吸等低風險樣品基質不僅有望加快生物標誌物的發現,而且更容易轉化為臨床環境。”
並非所有疾病都是平等的
一般而言,2 型糖尿病和心髒病等常見且易於理解的疾病具有最相關的生物標誌物,而各種自身免疫性疾病和神經系統疾病等罕見疾病則落後。造成這種情況的一個原因是,資源通常分佈在可以產生最大影響的地方——無論是在患者人數還是財務投資回報方面。大量患者群體還有助於揭示不同的疾病亞型。“將發現工作重點放在目前缺乏經過驗證的生物標誌物的條件上,以及識別反映疾病完整生物學譜的生物標誌物,對於開發相關的靶向治療至關重要,”Kinchen 說。
多路復用增加了生物標誌物發現的可能性
“從歷史上看,多重技術總是為發現新的生物標誌物打開大門,”Luminex Corporation 的高級現場應用科學家 Stephen Angeloni 博士說。“對於基因組應用,核酸陣列已經能夠識別數百種藥物基因組生物標誌物——例如,通過比較健康與疾病條件下的基因表達模式。迄今為止,其他多重生物標誌物應用主要集中在蛋白質生物標誌物上,例如細胞因子、趨化因子或肽激素。由於在面板內外切換不同目標的簡單性,其中許多已在 Luminex 平台上開發。現在,隨著多重基因組和蛋白質組學分析系統的出現,為新的生物標誌物發現定制設計多重檢測變得更加容易。”
多路復用的一個主要優點是,它允許研究人員盡可能廣泛地撒網,從而提高識別生物標誌物的機會。“通常,多個蛋白質的生物標誌物特徵可以比使用單一生物標誌物產生更高的診斷準確性,”瓊斯報告說。“例如,少數幾個獲得 FDA 認證的生物標誌物實際上是蛋白質的組合。” 去年發表的一項生物標誌物發現研究使用 RayBiotech 的抗體陣列技術分析了 630 名患有和未患有結核病的個體的 640 種蛋白質;這表明八種蛋白質的特徵具有最高的診斷準確性,獨立的測試隊列在驗證過程中表現出 83% 的特異性和 76% 的敏感性。
優化工作流程
優化用於生物標誌物發現的多路復用工作流程依賴於幾個最佳實踐。“預分析對於產生有意義的結果至關重要,”Polifke 說。“這意味著優化用於樣本收集的協議,對健康和疾病狀態的捐贈者進行細緻的表徵,並密切關注處理條件,包括溫度、運輸和儲存。評估生物標誌物的穩定性和被其他生物分子掩蔽的可能性同樣重要。雖然一些生物標誌物需要添加一般的蛋白質穩定劑——例如,用於基於血紅蛋白進行癌症篩查的糞便樣本——但其他生物標誌物可能需要使用去掩蔽稀釋劑,如LowCross-Buffer以確保准確的測量。” Polifke 還建議從專業公司(例如 in.vent Diagnostica 或 Central Biohub ®)採購經過驗證的樣品材料,以簡化表徵。
Kinchen 評論說,Owlstone 的技術重點的性質意味著開發另一種工作方式。“標準質量控制使用合併的技術重複來識別和量化分析變異,”他說。“然而,因為我們的技術涉及檢測氣態基質中的揮發性化合物——呼吸——產生真正的合併重複是具有挑戰性的。我們需要重新關注並開發最適合手頭矩陣的指標,基於評估化合物的背景信號、稀疏性和中值變異性。” 至關重要的是,雖然 QC 樣品的性質可能會有所不同,但應始終在多重檢測的整個開發和應用過程中對其質量指標進行評估。
瓊斯建議生物統計學家尋求建議前開始研究以確定應該採用的樣本和控制的數量,以獲得具有統計功效的數據。“生物統計學家還可以幫助進行數據分析,並可以為生物標誌物研究的下一步——生物標誌物驗證提供適當的樣本和對照數字,”她報告說。“我還建議先運行一個小型試點實驗,使用一些有代表性的樣本,然後再進入全屏。這有助於優化樣品稀釋,並根據樣品類型的檢測範圍和靈敏度確定平台是否合適。” 最後,Angeloni 評論說,無論是什麼應用程序,都無需擔心 Multiplex 平台中是否有您認為不需要的目標。“多年來,我的一些客戶提出了這個問題。