流式細胞術的抗體驗證
驗證提供了抗體識別其特定目標並在給定應用中發揮作用的證據。對於流式細胞術這種通常涉及同時檢測多個靶標的技術,必須確信抗體試劑的性能可靠。在本文中,四家受人尊敬的抗體製造商解釋了他們如何驗證用於流式細胞術的抗體並分享一些抗體選擇技巧。
驗證對於生成準確數據至關重要
根據 Cell Signaling Technology 流式細胞術小組的科學家 Rob MacDonald 的說法,抗體驗證的目標是能夠證明抗體與預期目標強烈結合,而不與其他目標結合。“抗體反應性應該在逐個物種的基礎上建立,除非目標與經過驗證的物種具有 100% 的序列同一性,”他說。“此外,抗體應針對將使用它們的每個應用進行驗證,每個驗證過程都應遵循明確定義且可重複的協議。” 重要的是,驗證應旨在反映抗體與已知生物學相一致的性能;這確保了準確的讀數,並能夠探索未知的生物學。一旦抗體製造商完成驗證,
驗證抗體用於流式細胞術的挑戰
在驗證用於流式細胞術的抗體時,難度通常取決於目標位置。“驗證用於活細胞的抗體可能很簡單,因為脫靶結合的潛力受到質膜的限制,這會阻止抗體進入細胞內靶標,”MacDonald 解釋說。“然而,驗證針對細胞內靶標的抗體通常更具挑戰性,因為流式細胞術不能提供高分辨率的亞細胞定位信息或對分子量的洞察。” 此外,雖然一些抗體在活細胞上工作良好,但在細胞固定和/或透化後可能無法發揮作用;在驗證過程中建立這一點是關鍵。
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與驗證用於流式細胞術的抗體相關的另一個挑戰在於確定合適的模型系統以確定抗體特異性。與蛋白質印蹟等技術依賴於從許多不同細胞類型匯集的樣本不同,流式細胞術可分析不同的細胞群,這意味著選擇合適的細胞類型進行驗證是關鍵。“驗證從了解生物學開始,”BioLegend 細胞分析產品經理 Kenta Yamamoto 報告說。“我們通常從引用特定目標表達的已發表文獻中尋找這些信息,以及查看該領域廣泛使用的其他克隆。
流式細胞術的多重特性帶來了其自身的問題。Bio-Rad 癌症產品經理 Justyna Zaborowska 博士指出,驗證用於流式細胞術的抗體通常涉及使用比許多其他免疫分析技術所需的更廣泛的對照。“常見的流式細胞術對照包括未染色細胞、同種型對照、僅二抗對照、雙重染色以及陽性和陰性對照,”她說。“每一項都提供了有關抗體性能的寶貴信息,以幫助確保正確識別出正確的目標。” 至關重要的是,一旦抗體經過單獨驗證,還必須評估它們在預期多重面板中的性能。
圖像:在刺激的 CD3 陽性細胞與匹配的同種型對照和未刺激的對照中確認 IL2 染色。A) 未刺激的細胞用 Alexa Fluor 700 偶聯的小鼠抗人 CD3 ( MCA463A700 ) 和 FITC 偶聯的大鼠抗人 IL-2 ( MCA1553F )染色。B) 用含有布雷菲爾德菌素 A ( BUF077A ) 的細胞刺激試劑刺激5 小時的細胞用 Alexa Fluor 700 偶聯小鼠抗人 CD3 (MCA463A700) 和 FITC 偶聯大鼠 IgG2a ( MCA6005F) 染色)。C) 用含有 Brefeldin A (BUF077A) 的細胞刺激試劑刺激 5 小時的細胞用 Alexa Fluor 700 偶聯小鼠抗人 CD3 (MCA463A700) 和 FITC 偶聯小鼠抗人 IL-2 (MCA1553F) 染色。在存在 10% 人血清的情況下,對淋巴細胞裂解的人血進行的所有實驗都對淋巴細胞進行門控。在 ZE5 細胞分析儀上採集的數據。圖片由 Bio-Rad 提供。
驗證是多方面的
“驗證遠非一個步驟過程,”Proteintech Group 研發經理 Sreethu Sankar 警告說。“相反,它涵蓋了從抗原設計和克隆選擇到所選應用中抗體性能評估的所有內容。” 他還指出,以應用為中心的抗體開發方法可以顯著提高最終產品的特異性和靈敏度,例如,在開發流式抗體時應使用基於流式細胞術的克隆選擇(而不是 ELISA)。“無論您是開發針對傳統免疫學靶標(例如 CD 標記物)的抗體,還是針對細胞內蛋白質(例如細胞因子或轉錄因子)的抗體,由於表位構象的差異,您不能指望為 ELISA 設計的抗體在流式細胞術中起作用,”他說。儘管如此,許多抗體確實適用於多種應用,但抗體性能應始終根據具體情況進行確認。
“在抗體可用於其他應用的情況下,通過各種技術進行測試有助於進一步驗證特異性,”山本指出。“例如,流式細胞術和蛋白質印跡法各自可能解決抗體的不同結合特性,分別用於檢測天然和變性蛋白質。” 可用的抗體數據越多,表明抗體發揮應有作用的證據就越多。“遵循類似協議的應用程序對驗證特別有幫助,”MacDonald 補充道。“以免疫熒光顯微鏡為例,它可以提醒研究人員注意在基於流式細胞術的驗證過程中產生的假陽性,因為它可以看到任何不正確的亞細胞定位。” 使用非基於抗體的技術(正交驗證)也有助於支持基於抗體的發現。
抗體選擇技巧
生成可靠的流式細胞術數據的第一步是從值得信賴的供應商處採購抗體試劑。“研究人員應始終審查製造商生成的數據,以確認抗體已通過流式細胞術驗證,在正確的細胞模型中,以及所有必需的對照,”Sankar 說。接下來,研究人員應遵循抗體製造商推薦的方案來保護抗體性能。值得注意的是,隨著人類外周血和小鼠組織等複雜細胞模型在研究中的頻繁使用,MacDonald 報告說,Cell Signaling Technology 在這些系統中通過流式細胞術驗證了其許多抗體,並且可以根據要求分享協議建議。
“在選擇尚未廣泛發表的克隆時,請與抗體製造商核對以確定進行了哪些類型的驗證研究,”山本建議。“當我們宣傳一種抗體是針對特定抗原產生時,我們會盡可能徹底地解決任何潛在的脫靶效應。我們總是樂於與研究人員分享這些信息,以幫助他們決定克隆是否適合他們的需求。”
最後,Zaborowska 強調了國際抗體驗證工作組 (IWGAV) 提出並發表在Nature Methods 上的指南,該指南為跨不同研究應用的抗體驗證提供了框架。“通過將我們的驗證方法與 IWGAV 提出的五個支柱保持一致,我們的目標是幫助研究人員產生最高質量的數據,”她說。“例如,我們經常使用 CRISPR/Cas9 介導的基因敲除、siRNA 介導的敲除和免疫沉澱,然後進行質譜 (IP/MS) 來確認抗體特異性。儘管驗證可能既昂貴又耗時,但提高已發表結果的價值和可重複性至關重要。”