質譜的樣品製備
樣品製備是任何實驗的重要步驟,無論是基因組學、物理學、化學還是臨床。不充分的樣品製備會產生可變且可能不准確的結果。雖然樣品製備試劑盒和方案種類繁多,但新的應用程序正在觸發新的方法開發,建立在現有方法的基礎上以實現更多用途。
這對質譜來說再正確不過了。長期以來,質譜法一直是鑑定和定量化合物的首選方法。然而,MS 的樣品分析帶來了獨特的挑戰。“重要的是確保正確去除乾擾化合物,例如鹽、緩衝液、去污劑、離子對試劑、藥物等,它們可能會影響靈敏度、特異性、儀器正常運行時間或提高電離效率的能力。無效的樣品製備會影響結果的質量和重現性,”賽默飛世爾科技生命科學質譜高級主管 Lisa Thomas 說。
你的最終目標是什麼?
在尋找基本的“淨化”方法時,在將樣品發送到質譜儀之前,您可以選擇多種樣品製備方法。雖然蛋白質沉澱、稀釋和液體提取等一些方法是最簡單、最便宜的樣品製備方法,但它們也會產生最髒的樣品洗脫液。低效的樣品前處理會導致更多的基質成分進入最終樣品和 LC-MS,從而導致離子抑制並降低儀器和色譜柱的性能。“有時,在樣品製備方面尋求速度和低成本的科學家會犧牲整個系統的樣品清潔度、重現性和穩健性。這可能會成為長期定量研究的一個問題,當需要低檢測限時,”Kim Haynes 評論道,
近年來,包括固相萃取 (SPE) 或免疫親和純化技術在內的增強型樣品製備方法的可用性改進了樣品製備,並針對更多的基質成分進行了去除,從而獲得更清潔的樣品以及更靈敏和更具體的結果。正交方法可以提供最高的特異性和靈敏度。混合模式 SPE 將反相和離子交換功能結合到一個樣品淨化中,可用於研究治療性肽或檢測低分析物水平。儘管這些方法提供了更高的清潔度,但它們傳統上很複雜。
新技術,例如 Oasis PRiME HLB,Waters 的一種反相 SPE 產品,旨在去除脂肪、磷脂、鹽和其他基質成分,為研究人員提供了一種簡單、快速的方案,以實現更高水平的淨化。該產品可用於去除酸、鹼和中性化合物中的這些基質乾擾,從而靈活處理任何樣品。“通過獲得更高的樣品清潔度,研究人員可以看到 LOD 和 LOQ 的改進、更清潔的 LC 色譜柱、更清潔的 MS 儀器和檢測,並降低了基質效應的風險,”Haynes 解釋說。
大多數藥物中常見的極性、可電離鹼等更難分析的分析物在準備 MS 分析時需要特別考慮。為了將混合模式離子交換的特異性與 Oasis PRiME HLB 的清潔度相結合,沃特世開發了 Oasis PRiME MCX,旨在比傳統離子交換方案更快地產生更清潔的提取物。
新的展望
樣品製備可以進一步簡化甚至消除嗎?Thermo Fisher 正在研究樣品製備技術的新進展,以最大限度地減少 MS 分析前的樣品製備。紙噴霧電離使用的溶劑體積要小得多,產生的溶劑廢物也很少,這可能消除液-液萃取的需要,以及隨後的額外處理步驟的需要,例如離心和手動製備。
樣品製備可以進一步簡化甚至消除嗎?
該技術靈活且與乾血斑兼容,這是一種在臨床實驗室中成為常規的樣本收集方法。當高濃度樣品從一個樣品轉移到另一個樣品時,通過為每個新樣品使用新的一次性小柱,紙噴霧電離也顯示出消除殘留的前景。作為 HPLC 的替代品,該技術明顯更簡單,沒有色譜柱或高壓溶劑,並且使經驗不足的操作員能夠繞過 HPLC 常見的問題,例如接頭洩漏和 LC 色譜柱老化。
另一種新方法,場不對稱波形離子遷移譜 (FAIMS) 技術,有利於涉及同量異位化合物的應用,其中多種蛋白質會產生許多與目標肽相似的肽片段。“對於蛋白質組學和臨床蛋白質組學,我們看到 FAIMS 有可能提高選擇性、特異性和靈敏度,解決複雜基質中具有挑戰性的分析物經常遇到的複雜問題,”托馬斯解釋說。
FAIMS 將進入 MS 的離子限制為目標離子,減少了分析中的肽數量,從而提高了靈敏度並能夠更快地定量更多蛋白質。“此外,將 FAIMS 與 LC-MS 相結合可以提供更高的清晰度,以通過更高質量的信息更快地推進後續實驗,”Thomas 補充道。
走向普遍
引入新方法可以以新的方式推進樣品製備,特別是將不同樣品類型的各種樣品製備方案整合到一種檢測中。Chromotek 和 PreOmics 開發了一種新的階段內尖端 (iST)-GFP-trap 方法用於樣品處理,以滿足運行多種樣品類型的實驗室的需求。“肽可以分成幾個部分或一步洗脫,以進行單次蛋白質組分析。PreOmics 董事總經理 Garwin Pichler 描述說,三步協議可用於任何起始材料,只需三個小時,而不是標準的兩天。
該方法是為臨床研究實驗室開發的,特別是那些處理數千個不同樣品並針對每種樣品類型優化方案的實驗室。創建一個可以由任何用戶運行多個樣本並適應高通量儀器的強大協議,使蛋白質組學研究更容易進行。通過補充一種通過同量異位標記將多路復用引入 MS 的附加方法,稱為串聯質量標記 (TMT),可以在更少的運行中處理更多的樣品。不同的樣本被標記,每個樣本都帶有特定的標籤,然後混合以在一次運行中測量所有樣本,從而提高每個樣本的通量和靈敏度。
ChromoTek 有很大一部分客戶使用 GFP-Trap 對感興趣的 GFP 融合蛋白進行免疫共沉澱,以通過 MS 分析相互作用的伙伴。與來自 MPI 慕尼黑曼恩實驗室的公司 PreOmics 合作,開發出一種通用樣品製備套件,能夠進行如此乾淨的樣品製備,據報導,核心設施已經開始推薦它以獲得獨立於用戶技能集的一致可重複結果。使用組合的 iST GFP-Trap 試劑盒,用戶可以在不到四小時的時間內有效地從細胞中提取 GFP 融合蛋白並處理該樣品以進行 MS 分析。
新套件通過消除或組合多個步驟並在單個封閉體積中執行所有處理來簡化蛋白質組樣品製備。為了驗證 iST 方法,該小組使用該試劑盒在一天內獲得了迄今為止最大的芽殖酵母和裂殖酵母的蛋白質組覆蓋率。他們還應用階段內尖端方法對人類細胞系進行了四次重複測量,並獲得了 9,667 種人類蛋白質的拷貝數估計值,觀察了重複之間強大的定量重現性。
集成和自動化
Shimadzu Scientific Instruments 的生命科學產品經理 Brian Feild 注意到的一個新趨勢是希望加載樣品並離開,讓系統獨立執行樣品製備、LC 和 MS。這不僅可以更快地處理樣品,而且還允許任何用戶,無論是否精通 MS,都可以執行實驗以及從一個實驗室到另一個實驗室的無縫轉換工作流程。
“自動化已經不夠了,”菲爾德解釋說。“您還需要在 LC-MS 系統中集成自動化平台,以幫助提高重現性並實現更高的實驗室效率。集成的工作流程可以促進易用性,最大限度地減少錯誤,並實現樣品的快速周轉。” CLAM-2000 是同類中第一個完全集成的系統,具有適用於小分子分析的 LC-MS 樣品製備自動化。該儀器從樣品製備到注射並行處理樣品,用於常見應用,包括研究免疫抑製劑、維生素 D、治療藥物監測以及藥物開發和檢測。
對於更複雜的工作流程,島津正在投資專門用於質譜前樣品製備的化學方案。“最近,人們對可用於單克隆抗體和 DMPK 研究的大分子工作流程越來越感興趣,在這些工作流程中,樣品製備可能需要更多時間和計劃。一種可用於任何分子的方法簡化了樣品製備和 LC-MS 的過程,”島津製藥營銷經理 Gurmil Gendeh 解釋說。島津利用名為 nSMOL 的新技術將納米技術引入 MS 樣品製備。納米粒子被用來捕獲針對任何分子的抗體,以與所有可用的治療抗體一起使用。nSMOL 在一個工作流程中包含一個適用於任何臨床樣本的通用試劑盒,比配體結合分析和傳統 LC-MS 等傳統方法花費的時間要少得多。
為了更進一步,Perfinity 工作站和集成消化平台可自動執行親和捕獲、緩衝液交換、快速胰蛋白酶消化、脫鹽和反相色譜。該過程將蛋白質流過胰蛋白酶隧道,以便輕鬆獲取蛋白質上的賴氨酸和精氨酸,從而將消化時間縮短至 1-8 分鐘,而不是過夜。該系統加速了 MS 從發現和開發到製造中更規範的 QA/QC 空間的移動,合併了從樣品製備到 MS 的整個過程。例如,將 Perfinity 與其他系統(如生物反應器和 C2MAP)串聯,可以實現持續和自動化的細胞培養監測。這些技術正在實現從批量製造到連續製造的轉變,
速度、高通量和多功能性包括用於質譜中樣品製備的新技術。自動化和標準化都能夠在不影響質量和重現性的情況下,將方法從實驗室轉移到實驗室,從用戶轉移到用戶。鑑於當前和即將到來的進步,質譜似乎有望成為任何領域和行業的主要定量和檢測方法。