改進質譜蛋白質組學工作流程
隨著生物檢測數量的增加和規模的縮小,樣品製備對於從難以獲得的樣品中獲得最大收益具有更大的意義。特別是,蛋白質組質譜 (MS) 工作流程的樣品製備不僅必須考慮樣品——其可用性、基質、均質性和穩定性——而且還必須考慮與分離方法(例如液相色譜或毛細管電泳)和質譜的兼容性儀器本身。
通過以高精度和高靈敏度鑑定和表徵肽、氨基酸及其變體,MS 已經開始主導蛋白質組學分析。然而,蛋白質組學-MS 工作流程在輸入和預期輸出方面非常多樣化。樣品在豐度、物理形式和同質性方面各不相同。雖然這在生物學中並不罕見,但樣品和製備環境或基質必須與 MS 電離和檢測兼容,因此“稀釋和噴射”通常不是一種選擇。此外,這些不確定性引發了方法穩健性、讀數一致性和定量測量準確性的問題。
在本文中,我們與蛋白質組學 MS 的兩位專家進行了交談:高級研發經理 Ryan D. Bomgarden 和 MS 研究科學家 Sergei Snovida,他們都在 Thermo Fisher Scientific。由於蛋白質組學-MS 樣品製備的詳盡指南會佔用很多篇幅,我們希望我們的專家提供的技巧能夠提高對主要問題的認識,並使用戶走上回答有關改進 MS-蛋白質組學工作流程的關鍵問題的道路。
標準化
標準化分析工作流程可以採用多種形式,從分析協議本身開始。“蛋白質組學-MS 工作流程的樣品製備傳統上是自製的,”Bomgarden 說。分析人員從他們對 MS 的知識、類似樣本類型的經驗中藉鑑了一些知識,並將已發表的協議和他們自己的經驗聯繫起來。“這些準備工作中的許多工作正常;但它們沒有針對一種特定的樣本類型進行優化,或者就此而言,沒有標準化,以便可以共享和依賴協議以在不同的人手中提供可比較的結果。這導致了研究人員的需求用於市售試劑盒。”
標準化或缺乏標準化一直是科學中的一個問題,並且是生物醫學研究中可重複性危機的一個促成因素 。核心實驗室通常要求提交樣品進行 MS 分析的科學家遵循標準化的樣品製備方案,這越來越意味著商業試劑盒具有用於蛋白質還原、烷基化、消化和淨化的優化、預先配製的試劑。
自動化
雖然商業試劑盒有助於在檢測水平上實現一致性,但它們無法解決不穩定、異質或稀有樣品的常見情況。試劑盒可確保每個樣品都經歷相同的製備和分析條件,但它們不能增加可用樣品的數量,也不能將其擴展到每天數十或數百次分析。毫不奇怪,隨著樣本數量的增加,單個化驗的物理體積會縮小,需要更精確地輸送極少量的樣本和試劑。
“對於非常小的樣本量——甚至是單個細胞——或大量樣本,自動化是實現一致性的唯一途徑,”Bomgarden 說。
強調一致性而不是吞吐量符合美國食品和藥物管理局關於質量和風險的舉措,但節省的時間也不容小覷。根據 Bomgarden 的說法,典型的蛋白質組學樣品製備可以從兩三天減少到一個早上或更短時間,具體取決於樣品類型和自動化水平。
注意你的干擾
儘管基因、蛋白質、代謝物、脂質等的全局表達,組學可以被視為研究生物事件的不同方式。串聯分析,例如對同一樣本的蛋白質組學-基因組學或蛋白質組學-代謝組學,越來越流行。在這些情況下,首選適用於兩種分析模式的單一製備方案,但其實現可能難以捉摸。統一的方案必須考慮相對豐度、濃度動態範圍和乾擾——促進一種模式但抑制另一種模式的試劑。
“用於基因組學研究的 DNA 製備通常包括用於細胞裂解或蛋白質溶解的試劑,它們會干擾蛋白質組學 MS 樣品製備或分析,”Snovida 說。“自製製劑特別麻煩,因為它們可能含有去污劑或非揮發性鹽。用於裂解的非離子去污劑,例如 Triton X-100 和 NP-40,很難去除。磷酸鹽或 Tris 緩衝液可以去除,但它們不揮發性,因此它們與 MS 不相容。這就是為什麼我們建議在 MS 樣品製備中使用揮發性鹽和酸,如碳酸氫銨或甲酸,而不是基於鈉或磷酸鹽的緩衝液。”
觀察樣品均勻性
許多蛋白質組樣本,尤其是通過活檢或手術獲得的樣本,在可及性和數量方面受到限制。眾所周知,腫瘤也是異質性的,大多數切除術包括正常細胞的邊緣。簡單地將組織樣本切成兩半並不能保證每個部分都包含相同的蛋白質組分析物。
“研究人員擔心樣本偏差,但通常的做法是將樣本分成兩份,一份用於蛋白質組學,另一份用於基因組學,”Bomgarden 告訴 Biocompare。
在尺寸範圍的另一端是微小的樣品。“每個操作步驟都涉及損失,隨著樣品接近檢測極限,總可用蛋白質變得微乎其微,直到單個細胞的含量,損失變得更加重要。請記住,與 DNA 或 RNA 不同,我們不能擴增目標蛋白質來補償小樣本量或樣本損失。” 痕量分析物的測量也很困難,因為來自高豐度蛋白質(例如血液中的白蛋白)的干擾可能會阻礙 MS 檢測。
優化蛋白質組學 MS 樣品製備可以在通量、一致性和結果質量方面帶來巨大收益;但這些努力是以犧牲靈活性為代價的。分析科學家天生好奇並喜歡實驗。採用由產品開發科學家開發的標準試劑盒、協議和方法,並且通常遵循配方可能會削弱他們的能動性或創造力。事實上,優化蛋白質組學樣品製備恰恰相反,將它們解放出來用於解決更高層次的問題。