聚醣分析成為 QC 專長
糖基化是許多治療性蛋白質,尤其是單克隆抗體 (mAb) 的重要翻譯後修飾,已成為一項大生意。由於聚醣構建塊、鍊長和排列(包括位置和結構異構體)的無限組合以及糖在分析上幾乎無法區分的事實,聚醣分析已成為越來越多外包的分析專業。由於糖基化是單克隆抗體的主要“關鍵質量屬性”,聚醣分析包含了一種重要的方法來進行過程監控、質量控制,以及對如此指定的藥物,用於建立生物相似性。聚醣及其在蛋白質中的表達類似地用作表達 mAb 和其他生物治療藥物的細胞系的選擇標準。
Move over, LC-MS
液相色譜-質譜 (LC-MS) 已成為聚醣分析的標準分析平台,但關鍵結構的基線分辨率可能需要幾個小時。即便如此,異構聚醣和糖肽或具有相似或相同質量的那些也並不總是分開。2021 年 6 月,MOBILion Systems 基於太平洋西北實驗室於 2015 年開發的新型分離技術,推出了公司首個商用高分辨率離子遷移率質譜 (HRIM-MS) 系統 MOBIE。 MOBIE 背後的驅動力是“結構無損離子操作”(SLIM),它需要很長的離子遷移率分析路徑,並將其多次折疊回自身,從而減少了其占用空間。例如,對於常規實驗室分析不切實際的 13 米線性流路,可以縮小到公文包大小。進入分析路徑的物質由圍繞路徑轉彎的電場引導,以避免分析物和設備之間發生碰撞,因此用“無損”一詞來描述分子路徑。
HRIM-MS 在幾個方面與 LC 不同。首先,它發生在氣相與液相色譜的溶液中。LC 根據電荷或分子量分離分子,而 HRIM-MS 則利用分析物的大小、電荷、形狀和結構。HRIM-MS 還將分析時間從典型的 15 分鐘縮短到 3 小時,再到大約兩分鐘,從而從根本上消除了通量瓶頸。該技術適用於從研究階段到生產階段的單克隆抗體、完整和亞單位蛋白、肽和聚醣。
“高度相似的生物分子(如許多聚醣)的 LC 分離需要延長運行時間,這在分析工作流程中造成了潛在的瓶頸,”MOBILion Systems 首席執行官 Melissa Sherman 博士說。“即便如此,一些聚醣的行為非常相似,無法避免 LC 共流出。相比之下,使用支持 MOBIE 的 MS 系統運行兩分鐘為研究環境中的蛋白質、肽、聚醣和 PTM 的分離和分析提供了高通量和分辨率選項。我們相信該方法可能會降低在過程監控和製造中採用更複雜的基於 MS 的表徵分析的障礙。”
許多(如果不是所有)分析聚醣的分析師都在努力解決“異構體”問題——相同的分子量,但糖殘基的排列不同。“HRIM-MS 確實可以幫助識別具有更高分辨率和通量的異構體圖譜,”Sherman 告訴 Biocompare。“糖基化曲線需要在大約兩分鐘內通過 LC 解析與 HRIM 進行 6 小時的分離。”
多層次的可能性
對治療性蛋白質(又名“糖蛋白質組學”)的聚醣分析發生在大約四個層次上:在完整蛋白質上,通過部分消化的蛋白質,在單個糖基化肽上,以及在首先從蛋白質中釋放聚醣之後。
糖鏈分析水平取決於調查的目的和具體的分析物結構,基因編輯治療公司 Prime Medicine 的高級科學家 Yang Yang 博士說。“例如,當一種蛋白質中有多個聚醣位點時,您可能需要將該蛋白質消化成糖肽以研究每個單獨的位點。” 在分子表徵過程中也可能涉及幾個“水平”,為監管提交做準備,“其中使用多種正交方法在釋放的聚醣、糖肽和完整糖蛋白水平上表徵聚醣。”
分析人員求助於釋放的聚醣,對細胞、組織或血漿/血清表達的糖蛋白上的單個 N- 和 O-糖基化位點進行準確、全面的聚醣分析。
另一方面,糖肽分析用於研究一種或多種蛋白質上的聚醣。“這種方法的主要特點是能夠將糖基化信息與蛋白質的糖基化位點聯繫起來,”CD BioGlyco 的研究科學家 Linda Brown 說。“然而,需要對完整糖蛋白治療劑進行分析,以量化純化糖蛋白治療劑的 N-/O-糖基化,包括計算每個聚醣在糖基化位點上的百分比並估計每個 N/O-聚醣的結構。”
BioGlyco 專門通過聚醣分析改進生物治療藥物,這是一種普遍未充分利用的具有巨大潛力的策略。
我們傾向於認為聚醣分析主要與質量功能相關,但糖蛋白組學在藥物發現和創建現有生物藥物的改進版本方面也發揮著作用。
“糖基化是一個非常有前途的目標,具有巨大的個性化醫療潛力,”布朗繼續說道。“聚醣在生物過程中發揮著重要作用,包括細胞粘附、大分子相互作用和病原體入侵。糖組學補充基因組學、代謝組學和蛋白質組學,並顯示出個性化醫療的前景。例如,某些疾病的糖生物標誌物可能對個體具有特異性,因此針對特定的蛋白質糖基化是臨床治療的一種有前途的策略。” 這些策略可以應用於現有的“個性化”生物治療藥物,以及專門針對糖基化的新化合物。
全階段活動?
由於所涉及的專業知識和時間,生物治療藥物的開發人員傾向於為產品生命週期的書擋保留聚醣分析 – 在發現和開發的最早表徵階段以及 QC。隨著糖基化作用的深入了解,這種情況正在發生變化。
“糖蛋白在分子和細胞功能中起著關鍵作用,”Creative Biolabs 首席技術官 Jing Zhang 博士說。“治療性糖蛋白的穩定性、血清半衰期、免疫原性和生物活性受其糖基化特徵的調節。因此,在生物製劑的所有開發階段對糖基化表徵的需求不斷增加。”
越來越多的開發人員在生產過程中以及質量測試中進行聚醣分析。Creative Biolabs 專注於對抗體、Fc 融合蛋白、非 Fc 融合蛋白和糖工程細胞系進行高通量聚醣篩選的策略。“最重要的是,分析是實時進行的,以監控生產過程。” 一種涉及通過 UHPLC 和熒光檢測進行高通量聚醣篩選的策略,可在兩週內篩選多達 100 個樣品,並使用粗澄清培養基。張說,第二次通過基於熒光標記的凝集素的方法進行高通量篩選,大約需要兩個小時。
隨著糖基化的重要性得到更好的理解,聚醣分析正成為一項需要時間、儀器和專業知識的專業活動,而藥物開發人員越來越缺乏或不願獲得這些活動。由於糖基化修飾的 QC 僅在特定時間發生(儘管頻率越來越高),因此與在內部維護此功能相比,聘請第三方服務提供商可能更方便且更具成本效益。
全球有 130 多個組織專門從事聚醣分析。根據英國研究公司Roots Analysis 的一項研究,該細分市場的年增長率將在未來幾年內增長 15%,該細分市場服務於每年 1300 億美元的糖基化蛋白質藥物市場的需求。