ELISA 故障排除指南
ELISA 是應用最廣泛的免疫分析技術之一,它快速、簡便且操作成本相對較低。但是,就像任何免疫分析一樣,它可能會出錯。在本文中,我們重點介紹了一些常見的 ELISA 問題並提出了克服這些問題的方法。
ELISA 具有許多優勢
自 ELISA 首次在文獻中描述為定量兔 IgG 的手段以來,已有 50 年。從那時起,它已經演變成一種適用於多重應用和高通量篩選的基於平板的方法——它的受歡迎程度沒有減弱的跡象。根據 Jackson ImmunoResearch 科學傳播經理 Miranda Lewis 博士的說法,ELISA 的優勢包括卓越的靈敏度和穩健性,前提是它使用高質量試劑和適當的對照進行配置。“與蛋白質印蹟等技術相比,ELISA 的主要優勢在於它允許研究人員測量分析物濃度,即使在復雜樣品中目標生物分子的含量很低,”她說。“然而,為了獲得準確的結果,在 ELISA 工作流程的每一步都使用經過驗證的試劑並獲得可靠的對照至關重要。”
ELISA常見問題
要求任何研究人員描述他們在運行 ELISA 時遇到的問題,您可能會發現高背景是最重要的。CANDOR Bioscience 聯合創始人兼董事總經理 Tobias Polifke 博士評論道:“高背景通常是由於封閉不良造成的,這可能是由於使用效率低下的封閉試劑,如 BSA。雖然 BSA 廣泛用於阻斷源於這樣一個事實,即它是上個世紀第一個大量可用的純化蛋白質,但現代替代品提供了顯著的改進。例如,已經開發出的試劑可以更快地在微孔板表面形成更緻密的層,從而大大降低非特異性結合效應的風險。” 其他高背景來源包括洗滌不充分和抗體性能差,—另一個常見的 ELISA 投訴。“當捕獲和檢測抗體在夾心 ELISA 過程中競爭相同的表位時,或者當分析物特異性抗體對目標的親和力低時,可能會出現弱信號,”Lewis 評論道。然而,她警告說,雖然將次優 ELISA 性能歸咎於抗體試劑可能是本能的,但許多其他因素也可能在起作用。
有效的解決方案
當 ELISA 出錯時,診斷和解決任何問題似乎令人生畏。但是,無論您遇到的是背景高、信號弱還是重現性差,其他研究人員以前都會遇到類似的問題,通常可以提供幫助。下表列出了一些常見的 ELISA 投訴,並包括建議的解決方案,以幫助您的檢測重回正軌。
高背景
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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阻塞不足 | 改用不同的封閉試劑或經認證不含 IgG 和蛋白酶的 BSA 來源
增加封閉試劑的濃度 延長封閉孵育時間 |
洗滌不充分 | 增加洗滌步驟的數量、體積和/或持續時間
在洗滌緩衝液中加入低濃度的去污劑(例如 0.01–0.1% Tween-20) 檢查井在洗滌之間完全清空 考慮自動化洗滌步驟而不是手動執行 |
樣品太濃 | 連續稀釋樣品以確定更合適的濃度 |
抗體濃度過高 | 滴定抗體試劑以確定合適的濃度
減少抗體孵育步驟的持續時間 |
由於抗體稀釋劑選擇不當造成的干擾(例如,BSA/PBS/Tween-20) | 改用不同的抗體稀釋劑 |
二抗非特異性結合 | 運行不含一抗的對照
考慮使用交叉吸附二抗 使用親和力區分稀釋劑以避免低親和力結合效應 |
比色底物準備得太早 | 在使用前立即準備比色底物(例如 TMB、OPD 或 pNPP)
改用穩定的比色底物(可從各種來源購買) |
停止液(比色檢測)在孔中停留時間過長 | 加入終止溶液後立即讀取比色測定(除非製造商另有指示)
標準化並記錄底物的孵育時間、終止溶液和讀出前的時間 |
存在污染 | 為每次檢測準備新鮮的緩衝液或在 4 o C 下短期儲存緩衝液(如果合適),使用前將它們置於室溫
每一步都使用新鮮的塑料器皿(例如移液器吸頭、儲液器) |
孵化時間過長 | 在檢測開發過程中優化孵育時間,然後遵守協議 |
信號弱或無信號
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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抗體對靶標的親和力較差 | 確認抗體試劑經驗證可檢測所選樣品類型和物種中的靶標
檢查抗體是否經過 ELISA 應用驗證 改用替代抗體 |
捕獲抗體或抗原未與微孔板結合 | 檢查微孔板是否已針對 ELISA 應用進行驗證,並根據製造商的說明確認其結合能力
切換到使用不同的塗層緩衝液 增加包被步驟的孵育時間和/或溫度 |
抗體濃度過低 | 滴定抗體試劑以確定合適的濃度
增加抗體孵育步驟的持續時間 |
檢測抗體與二抗不相容(間接檢測) | 檢查二抗是否識別檢測抗體(例如,抗兔二抗應與兔宿主中產生的檢測抗體配對) |
捕獲和檢測抗體結合相同的表位(夾心 ELISA) | 確認捕獲抗體和檢測抗體識別不同的表位(請參閱抗體製造商的數據表)
如果可用,用匹配的抗體對替換兩種分析物特異性抗體 考慮使用不同的 ELISA 格式(例如從夾心 ELISA 轉換為直接 ELISA) |
解決方案很冷 | 除非協議中另有說明,否則在使用前將所有溶液置於室溫 |
疊氮化物抑制 HRP 活性 | 確保緩衝液不含疊氮化物
如果可用,用匹配的抗體對替換兩種分析物特異性抗體 進行充分洗滌以去除隨檢測抗體引入的任何殘留痕量疊氮化物(疊氮化物通常用作抗體防腐劑) |
樣品僅包含低濃度的分析物 | 確認樣品選擇是否合適(參考 UniProt、PAXdb 或 proteinatlas.org 等網站,以及抗體製造商的數據表,了解有關蛋白質表達的信息)
獲得更濃縮的樣品 用已知量的分析物添加樣品以檢查樣品基質不會干擾檢測 |
試劑儲存不正確 | 請參閱製造商的存儲說明
避免不必要的凍融循環(如果合適,準備冷凍等分試樣) |
以錯誤的波長讀取板 | 檢查酶標儀是否支持所選讀數 |
檢測方法不夠靈敏 | 從使用直接檢測(使用標記的分析物特異性抗體)切換到間接檢測(使用標記的二抗)
考慮使用更靈敏的讀數(例如,從使用比色檢測切換到使用增強化學發光) 進行信號放大(例如,使用生物素化的二抗和標記的鏈黴親和素試劑) |
板之間的可變性
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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板材塗層不均勻 | 確保塗層溶液充分混合
在塗層步驟中密封板以防止蒸發 確認移液器已校準 在塗層過程後立即使用塗層穩定劑(即使板在使用前不會長時間存放)以減少孔與孔之間的不一致性 |
洗滌不充分 | 增加洗滌步驟的數量、體積和/或持續時間
在洗滌緩衝液中加入去污劑(例如 0.01–0.1% Tween-20) 檢查井在洗滌之間完全清空 考慮自動化洗滌步驟而不是手動執行 |
井裡有氣泡 | 讀數前輕輕脈衝離心微孔板
改進移液技術 考慮自動化試劑添加 |
板密封是交叉污染的來源 | 在孵化之間使用新鮮的板密封 |
運行之間的可變性
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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檢測條件不一致 | 始終在穩定的環境條件(溫度、孵育時間、空氣濕度、避免陽光直射)下運行 ELISA
遵守協議 每次引入新批次的試劑時進行比較研究 |
樣本已被洩露 | 將樣品置於冰上,避免重複凍融 |
試劑 變質了 | 為每次檢測準備新鮮試劑
檢查標準品和質控品是否已正確準備和儲存 |
邊緣效應/板漂移
可能的原因 | 建議的解決方案 |
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板沒有正確密封 | 確保正確應用板密封以防止蒸發 |
解決方案很冷 | 除非協議中另有說明,否則在使用前將所有溶液置於室溫 |
試劑添加時間過長 | 盡快將試劑添加到微孔板中,避免延誤
為每次運行準備適量的試劑,記住考慮死體積 盡可能使用多道移液器並標準化移液方法 |
包被的抗體或抗原的不穩定性 | 在塗層過程後立即使用塗層穩定劑(即使板在使用前不會長時間存放)以減少孔與孔之間的不一致性 |
移液器沒有準確和/或一致地分配 | 確認移液器已校準 |
波動的環境條件 | 避免在環境條件可能變化的地方孵化板(例如,靠近產生熱量的設備、通風口下方、陽光直射下) |
讀板器未對準 | 將板旋轉 180 o並重新讀取以確定效果是否保持在同一位置;如果是這種情況,請致電服務工程師 |
板塊相互交叉污染 | 避免在孵化期間堆疊板 |