為您的色譜系統準備和使用緩衝液的技巧
色譜法 是一種流行的純化技術,用於世界各地的實驗室。如果系統設置和操作正確,它可以立即從混合物中分離出所需的化合物。雖然,像許多淨化方法一樣,快速有效地設置和維護您的系統需要一點時間來掌握。話雖如此,提高系統性能的重要但經常被忽視的技巧之一是了解如何使用和製備緩衝液和溶劑。即使是最簡單的元素,如緩衝液製備,如果做得不好,也可能導致結果不一致和寶貴樣品的損失。準確製備和正確選擇緩衝液對於在色譜中獲得可重現的結果至關重要。
了解您的化合物
這可能看起來很明顯,但有時我們只想要結果並匆忙進行實驗,而沒有花時間做一些背景研究。如果您正在尋找混合物中的特定化合物,您應該使用最能將您的分析物與其他分析物分開的緩衝液/溶劑組合。例如,了解極性和溶解度(極性或非極性)、電離、UV 吸光度將有助於指導您選擇特定的色譜柱和溶劑組。有多種資源可根據分析物的特性為您提供指導。ChromaBLOGraphy 和CHROMacademy 這兩個有助於解釋 HPLC 分離的緩衝液選擇。ZirChrom 提供了一種工具,旨在幫助您進行簡單註冊後製備用於液相色譜的 pH 緩衝液所需的計算。
質量很重要
使用較低等級和較便宜的試劑來製作緩衝液以節省一些錢是很誘人的,但從長遠來看,它最終會變得更加昂貴。與含有最少或不含雜質的 HPLC 級試劑相比,純度較低的試劑會導致不需要的峰和嘈雜的基線。它們還會對您的系統造成嚴重破壞,造成堵塞,從而導致系統故障和更昂貴的維護。所有試劑和溶劑,包括您使用的水,都應該是最高質量的 HPLC 級,以減少緩衝液中不需要的顆粒。高檔試劑的價格可能比低檔試劑略高,但純度的差異是值得的。HPLC 級試劑還有助於獲得更一致的結果並保持您的系統平穩運行。HPLC 級試劑可從多種來源獲得,
過濾掉不好的東西
儘管通過使用 HPLC 級試劑,緩衝液可能是化學純的,但在製備緩衝液時可能存在灰塵、瓶蓋顆粒物或鹽沉澱。要去除這些不需要的顆粒,請在緩衝液製備好後對其進行過濾。為獲得最佳結果,請在使用前對緩衝液和溶劑使用 0.45 µm 過濾器。過濾後,溶劑應儲存在有蓋的容器中,以防止被灰塵或其他不需要的材料污染。
擺脫氣泡
在與您的系統一起使用之前對緩衝液進行脫氣和/或真空過濾可以最大限度地減少流動相中的空氣和顆粒。最近對許多儀器產品的改進現在提供在線脫氣機來解決一些問題,但不是所有與流動相中溶解空氣相關的問題。如果您的液相色譜系統內發生流動相脫氣,它主要會影響泵和檢測器。為此,在將新鮮製備的流動相泵送至 HPLC 系統周圍之前進行脫氣,連同在線脫氣機,應徹底脫氣以去除所有溶解的氣體。最有效的脫氣形式是用氦氣或其他低溶解度氣體鼓泡。如果此方法可用,建議在整個分析過程中對流動相持續以非常低的水平脫氣。
視力檢查
雖然細菌似乎不太可能在您的溶劑緩衝液中生長,但它們可以。細菌幾乎可以在任何溶液中適應和生長,甚至是有機溶劑,具體取決於濃度。為防止細菌生長堵塞色譜柱篩板,每次製備新的緩衝液批次時都要更換緩衝液槽,並目視檢查緩衝液瓶/袋是否有細菌生長的跡象。搖晃或攪拌時出現渾濁的溶液應丟棄。用抑菌劑(如 0.02% 疊氮化鈉)處理會延長溶液的儲存時間,儘管這些製劑可能會影響您的色譜圖。
新鮮的往往是最好的
為獲得最佳結果,請根據需要使您的解決方案新鮮。設置丟棄未使用緩衝區的到期日期。雖然您可以獲得更長的穩定性,但許多實驗室都指定稀釋緩衝液的有效期為 1 週。這種做法可確保緩衝液的 pH 值不受長期儲存的影響,並且不存在微生物生長。pH 值變化和微生物生長都會影響您的色譜運行並導致運行之間的不一致。儘管您可以添加焦亞硫酸鈉等穩定劑,但這些穩定劑會影響光學和色譜結果。
總結一下
色譜法可能是一項很難掌握的技術。遵循上述有關如何準備和使用用於純化的緩衝液的提示,將有助於使每次運行保持一致和可重複。
文章作者-Terri Thompson