兩種層析的故事 HPLC vs FPLC

HPLC 與 FPLC：兩種層析技術，不同目標與應用領域

「這是最好的時代，也是最壞的時代」常被用來形容研究者面對複雜分離實驗時的心情。層析分離作為分析流程的早期核心步驟，往往決定研究計畫的成功與否。高效液相層析（HPLC）與中低壓層析（FPLC，Fast Protein Liquid Chromatography）是廣泛使用的兩種方法，皆可用於從複雜溶液中分析並分離分子，尤其是蛋白質。兩者同源，但在壓力、目的與操作型態上有明顯差異。

系統壓力：兩者的根本差異

HPLC 與 FPLC 最主要的差異在於工作壓力範圍。HPLC 在高壓下操作，FPLC 則使用較低壓力系統。

• HPLC：使用高壓幫浦，可支援數十 MPa 的壓力，適用於分析與製備型操作。
• FPLC：為專用於蛋白質純化的液相層析技術，採用類似 HPLC 的原理，但操作壓力較低。

其他類 HPLC 技術包括：離子交換層析（IEX）、疏水相互作用層析（HIC）、尺寸排阻層析（SEC）與反相（RPC）層析。FPLC 也可使用 IEX、SEC、HIC，但多結合蛋白質專用的親和層析，如蛋白 A 或固定化金屬親和層析（IMAC）。

分離目標：分析 vs. 純化

HPLC 與 FPLC 最終目的不同，使得兩者的適用範圍也大不相同。

HPLC 典型用途：分離、鑑定與定量混合物中的特定成分，多與其他技術（如質譜 MS）聯用，分析後不一定保留樣品。

常見例子：

• 使用 Bio-Rad Aminex® 柱進行碳水化合物、醇類分析。
• 臨床檢測中分離 HbA1c 以評估糖尿病指標。
• 食品分析如乳製品中的蔗糖、乳糖與果糖定量。

FPLC 典型用途：從複雜樣品取得高純度生物分子（如蛋白質、DNA），用於後續功能或結構研究。為了取得足量純化蛋白，通常需要較大的進樣量。

層析管柱材料差異

HPLC 與 FPLC 所使用的管柱、固定相材料也大不相同。

HPLC：

• 使用更小的固定相粒徑（2–10 µm），提供高分辨率。
• 層析柱與系統多為不鏽鋼製，以承受高壓。
• 固定相以矽膠為主，部分採用壓力穩定的聚合物（如苯乙烯-二乙烯基苯）。

FPLC：

• 使用較大粒徑的凝膠，如交聯瓊脂糖、葡聚醣凝膠。
• 適用於低壓環境。
• 部分生物分子層析會使用聚丙烯酰胺或聚乙烯吡咯烷酮等材料。

兩者的重疊與誤解

FPLC 多被視為適合生物分子純化，因為其低壓條件較溫和。然而研究顯示，蛋白質在矽膠固定相上於高壓、高溫（60°C 以上）下亦能保持穩定，不會必然發生變性，打破了傳統認知。

優劣勢比較

HPLC 優勢：

• 更高效率與分辨率，現代 UHPLC 提供極高理論塔板數。
• 分離速度快，適合分析與定量。

HPLC 缺點：

• 苛刻的操作條件可能破壞某些生物分子。
• 可擴展性有限，不如 FPLC 適合工業級放大量產。

FPLC 優勢：

• 適用大型純化製程，能放大至工業規模。
• 能在高鹽、高 pH、含腐蝕性離子的條件下穩定操作。
• 適合保留蛋白質功能、構形與活性。

FPLC 缺點：

• 效率與解析度低於 HPLC。

持續創新與應用拓展

隨著技術持續發展，FPLC 效率正在提升。例如 Bio-Rad NGC 層析系統結合直觀的 ChromLab 軟體，可依實驗室需求彈性擴充並支援高度自動化，從探索性研究到工藝開發皆能應用。

總體而言，HPLC 適合分析（定量與定性），FPLC 最適合純化與製備。由於市面上工具與試劑選擇眾多，建議依需求比較不同系統，找出最適合研究方向的層析策略。

資料來源：Stephanie Runde，《FPLC 與分析型 HPLC：兩種方法，一個來源，許多差異》，Chromatography Online，第 12 卷，第 15 期，第 12–16 頁（2016）。
資料來源：https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/