兩種色譜的故事
“這是最好的時代,也是最壞的時代”通常適用於面臨具有挑戰性的分離實驗的研究人員。工作流過程中的這一早期步驟(通常是多個步驟)為項目的成功或失敗奠定了基礎。高效液相色譜 (HPLC) 和中壓或低壓色譜(有時稱為快速蛋白質液相色譜或“FPLC”)是兩種廣泛使用的方法,用於從異質溶液中分析和分離分子,尤其是蛋白質。HPLC 和中壓色譜法同源,它們有許多不同之處,使它們各自更適合實現某些分離目標而不是其他目標。
在壓力之下
首先,讓我們介紹一下這兩種技術之間的主要區別(線索在於它們的命名):它們的工作壓力。儘管 HPLC 在高壓條件下運行,但中壓色譜使用較低的壓力。“HPLC 描述了液相色譜的儀器實施,它使用流量恆定泵裝置,可以支持數十 MPa(兆帕)的壓力,用於任何可能的分析或製備目的,”應用開發經理和科學顧問 Frank Steiner 解釋說。 Thermo Fisher Scientific 的 HPLC、色譜和質譜。“中壓色譜是專用於蛋白質純化的液相色譜技術的一個子集,它應用了一些類似 HPLC 的技術,但壓力要低得多,”他補充道。
Steiner 列出了“類 HPLC”技術:離子交換色譜 (IEX)、疏水相互作用色譜 (HIC)、尺寸排阻色譜 (SEC) 和反相 (RPC) 色譜。典型的中壓色譜分離技術也在較小程度上使用 IEX(使用鹽梯度和 pH 梯度)和 SEC 和 HIC。此外,中壓色譜結合了“親和色譜技術,如蛋白 A 或固定化金屬親和色譜 (IMAC)”,Steiner 解釋說。
不尋常的目標
儘管術語之間存在一些交叉,但兩種主要色譜類型在壓力和最終目標方面仍然存在根本差異。
混合物中特定成分的分離、鑑定和定量是 HPLC 的典型目標。
Bio-Rad Laboratories 蛋白質純化全球產品經理 Candice Cox 舉了幾個例子:“使用 Bio-Rad Aminex® HPLC 柱分析碳水化合物和醇是一種常見的 HPLC 分離技術。” 她繼續說道,“此外,Aminex 色譜柱 採用了許多常用技術,如離子排斥、IEX、配體交換、SEC 以及 RPC 和高壓正相分配。這些多種相互作用模式提供了分離化合物的獨特能力。”
“通常對特定分子進行分析,例如將血紅蛋白 A1C 或糖基化血紅蛋白與其他血紅蛋白種類分離的臨床診斷測試,以確定 HbA1c 在糖尿病診斷和監測中的百分比,”施泰納通過進一步的例子提供。“每個樣本 45 秒,賽默飛世爾科技的 D-100™ 系統和試劑為 HbA1c 測試提供最快的結果,同時還能檢測遺傳血紅蛋白變異的存在。”
使用 HPLC 時,通常會直接使用另一種技術(例如質譜法)在線分析樣品,而不會收集以供進一步使用。
“應用 HPLC 的一個例子是 Bio-Rad Aminex HPX-87P HPLC 色譜柱,它用於食品檢測並提供乳製品中蔗糖、乳糖和果糖的分離度,可直接用於進一步分析,”Cox 證實。
另一方面,大多數中壓色譜的目的是從復雜的混合物中獲取純化的生物分子,如蛋白質,以用於下游的各種應用。與 HPLC 相比,為了獲得足夠量的所需產品,需要更大的樣品體積。Bio-Rad 的生命科學部門提供的樹脂和色譜柱能夠通過使用NGC™ 中壓色譜系統 或 Biologic LP 低壓系統分離複雜的生物分子混合物,例如單克隆抗體 (mAb) 或膜蛋白。
材料差異
這兩個色譜分支之間的另一個區別在於它們的樹脂組成。“通常,HPLC 樹脂的粒徑更小,適合更小的色譜柱,需要更高壓力的系統來分離樣品中的組分,”Steiner 強調說,並補充說 HPLC 系統和色譜柱通常由不銹鋼製成以承受高壓壓力。“由於粒徑通常在 2 到 10 µm 之間,較小的珠子直徑可實現更高分辨率的分離,”Steiner 分享道。
中壓色譜中使用的樹脂珠通常比用於 HPLC 柱的樹脂珠大,但珠有多種尺寸。“珠粒大小變化很大,這取決於純化樣品所需的特定純度和產量水平,”考克斯說。“通常,使用一種以上的色譜柱或樹脂類型或技術來達到所需的純度水平。例如,治療性 mAb 需要高純度和可接受的產量,以滿足製造商的安全性、效力和製造要求……[並]符合 FDA 規定,”她解釋道。
不僅僅是珠子大小不同;用於 HPLC 和中壓色譜的材料也各不相同。
HPLC 中的固定相主要是基於矽膠的,但也使用了一些壓力穩定的有機聚合物(例如,與二乙烯基苯交聯的聚苯乙烯)。經典的中壓固定相材料是交聯瓊脂糖或葡聚醣凝膠,其特點是壓力穩定性非常有限。其他有機聚合物凝膠,例如聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮,也可用於中壓色譜。“生物工藝樹脂正在不斷改進,”施泰納指出。“由聚苯乙烯二乙烯基苯製成的硬樹脂現在可用於 IEX 和 HIC,與過去相比,傳統的中壓應用現在可以在更高的壓力下進行。因此,目前兩種技術在固定相方面的重疊越來越多。”
重疊邊界
中壓色譜被認為更適合純化蛋白質或 DNA 等生物分子,因為工作流程是在較低壓力下進行的。通常,生物分子無法承受 HPLC 中常用的高溫、高壓或溶劑 [1]。然而,Steiner 認為這種過時的想法:“很多人認為蛋白質與硅膠基固定相不兼容、壓力升高和溫度升高,這會阻止 HPLC 在蛋白質分離中的應用。然而,這些限制在實踐中大多沒有證明是正確的,蛋白質可以在矽膠相上分離——即使暴露在幾十兆帕的壓力和 60°C 或更高的溫度下,也不會出現任何明顯的降解甚至變性。”
利弊
根據 Steiner 的說法,“HPLC 的效率更高。借助現代 UHPLC 技術,它可以提供更高的理論塔板數,並可以提供更高的分離速度,”每單位時間產生更多的塔板。他解釋說,理論塔板是假設的區域或階段,其中兩相(例如色譜運行的液相和固定相)相互建立平衡——簡而言之,理論塔板數越多,分離效率越高。“這得益於固定相中較小的粒徑,以及可以在顯著更高壓力下工作的儀器,”他補充道。
“HPLC 面臨的一個挑戰是,實現分離所需的苛刻條件會破壞最終產品的功能,”Cox 分享道。她補充說,如果保留最終產品不是您的主要目標,那麼這種負面影響就無關緊要,尤其是在高度分離是目標的情況下。“HPLC 能夠實現分析化學所需的高分辨率分離,”Cox 解釋說。
HPLC 的另一個缺點是其可擴展性更有限,而中壓色譜則不是這種情況。“中壓色譜技術的主要優勢在於它們可擴展到工業規模的蛋白質純化,此外還與具有高鹽含量、高 pH 值和腐蝕性鹽(如氯化物)的色譜柱具有出色的兼容性,”Steiner 解釋說。“相比之下,HPLC 的效率優勢難以超越半製備規模,儘管並非完全不可能。
Cox 支持中壓色譜法純化生物分子的優越性,他說:“使用中壓色譜法通常可以更好地純化生物分子,因為它們需要保持完整才能發揮功能或保持結構完整性。官能團通常無法承受 HPLC 所需的更高溫度、壓力或苛刻的溶劑,並且是治療學或結構生物學家作用機制研究的重要方面。” 然而,她承認中壓色譜的最大缺點是其效率較低。
持續創新
然而,隨著中壓色譜領域的不斷創新,效率正在穩步提高。“Bio-Rad 的 NGC 色譜系統具有直觀的 ChromLab 軟件,提高了效率,而且 [它] 很靈活,可以隨著實驗室的需求而增長,”考克斯舉例說,暗示其他儀器改進是一種獲得中壓色譜法遇到的理論塔板數較低。“該系統可以實現自動化,自動化程度由最終用戶決定。該系統可以配置為滿足探索性研究或通過需要優化和放大的工藝開發實驗室篩選候選藥物的發現實驗室的需求。”
Steiner 最後強調指出,最先進的蛋白質分析表徵能力非常有限,這也是中壓色譜的一個缺點;然而,他認為很難直接比較兩種色譜類型。“再次,我想強調的是,兩種儀器類型的設計都適合不同的目標,”他說。
最重要的是,HPLC 是分析的福音(例如,組分身份和數量),而中壓或低壓色譜最適合純化和生產。鑑於工具供應商提供的系統和試劑(例如色譜柱和介質)範圍廣泛,因此最好探索不同的系統並測試每個系統的性能以查看哪種系統最適合您的研究需求。
參考
[1] Stephanie Runde,FPLC 與分析型 HPLC:兩種方法,一個來源,許多差異。
色譜柱,LCGC,色譜在線.com,第 12 卷,第 15 期,第 12–16 頁,2016 年。