HPLC 系統選擇指南
分析支持研發的每個階段,對於生物醫學而言,這意味著高效液相色譜 (HPLC) 或液相色譜 (LC)。儘管選擇 HPLC 系統的過程對於每種情況和每個生命科學實驗室都是獨一無二的,但存在足夠的共性來證明 1000 字的指南是合理的。
商用 HPLC 由 Waters Associates(現為 Waters Corp.)於 1967 年推出,到 1980 年代已在許多(如果不是大多數)生物學和製藥實驗室中發現。2004 年,隨著沃特世商標超高效液相色譜 (UPLC) 的首次亮相,該技術進行了重大升級。競爭者起初很挑剔,主要是操作 UPLC 及其亞 2 微米色譜柱所需的高壓(以及隨之而來的問題),但最終每個主要製造商都開發了自己的版本,通常稱為 uHPLC。
UPLC 還是標準 LC?
沃特世首席產品營銷經理 Jim Karafilidis 表示,UPLC/uHPLC 顯著提高了液相色譜的分辨率、速度和靈敏度,並提出了有關將系統與工作流程匹配的有趣問題。
“分析科學家在 HPLC 或 UPLC 儀器之間進行選擇時會考慮許多因素。一個重要因素是購買價格,HPLC 系統的購買價格為 3 萬至 6.5 萬美元,而 UPLC 的價格在 5.5 萬至 12 萬美元之間。包括維護、支持和消耗品在內的持續成本是一個額外的問題。然而,雖然 UPLC 系統的初始購買價格高於 HPLC 系統,但 UPLC 的生命週期運行成本通常較低,與 HPLC 系統所需的樣品和溶劑相比,它需要的樣品和溶劑少得多。”
因此,在 HPLC 和 UPLC 之間做出決定通常歸結為生產力和效率。UPLC 系統提供超快速分析,可將運行時間減少 10 倍,溶劑消耗減少 15 倍。“這使科學家能夠在相同的時間內在 UPLC 系統上處理更多的樣品。UPLC 系統也更靈敏,並提供更高的分辨率和更高的峰容量。”
最後,Karafilidis 建議最重要的是,科學家根據他們獨特的方法和需求選擇液相色譜系統。他說,這種選擇“是基於政府實體(如 AOAC International 或各種藥典)制定的方法學中概述的標準,或內部標準操作程序,這些標準規定了必須實施的液相色譜儀器和色譜柱技術,以獲得合規和科學有效的結果。”
探測器
光電二極管陣列 (PDA) 和可調諧紫外 (TUV) 吸光度是生命科學中最常用的檢測器類型,尤其是在質量實驗室中。PDA 和 TUV 檢測髮色團——分子上吸收紫外線或可見光的區域——並在整個波長范圍內(從 100 nm 到 800 nm)或在選定的波長范圍內獲取 UV-Vis 光譜。TUV 也可以設置為監測多達四個可選波長。“這些檢測器最適合小分子藥物、天然產物或大分子生物藥物分析,”Karafilidis 告訴 Biocompare。
熒光檢測或 FLR 是包含熒光團(與髮色團相反)的分子的首選模式。FLR 檢測器用於含有熒光團的環境或食品樣品,或用於適當標記的蛋白質、氨基酸或聚醣。
“如果樣品缺少髮色團或熒光團,那麼通用檢測器如蒸發光散射檢測器 (ELSD) 可能是正確的選擇,”他建議道。
另一種基於折光率的專業檢測器最常用於分析醣類、聚合物、表面活性劑或其他不含髮色團的化合物。
“當需要確認性或更精確的化合物鑑定時,可以使用質譜檢測器。現代質量檢測器結構緊湊、堅固耐用,專為常規分析而設計,降低了樣品中痕量雜質因共流出而無法檢測到的風險。典型的質量檢測器在分析物濃度的幾個數量級內具有高度的重現性和準確度。“
“在需要時,分析方法以兩個甚至三個串聯檢測器為特徵來完全表徵樣品的情況並不少見。”
流路組成
HPLC 選擇的另一個因素涉及流體路徑的材料組成。買家現在有多種選擇,包括不銹鋼、鈦、PEEK 或採用新型表面技術的新型液相色譜儀之一。
自 HPLC 出現之初,不銹鋼一直是色譜儀和色譜柱的標準結構材料。
“不銹鋼強度高,容易獲得,而且相對便宜,”Karafilidis 說。“然而,眾所周知,不銹鋼硬件會導致某些含有磷酸根和/或羧酸根基團的分析物的峰形和回收率不佳,而其他具有富電子官能團的分析物則難以準確測量。當不銹鋼暴露於高酸性流動相或含有氯化物鹽的流動相時,隨著時間的推移,這些分析物的不對稱峰形和較差的回收率只會惡化。”
幾十年來,解決方法是使用替代金屬和聚合物,例如鈦和鎳鈷合金或 PEEK,用於 HPLC 系統流路中的組件。
“雖然這些材料提高了耐腐蝕性,但非特異性吸附仍然會引起問題。另一種臨時解決方法是在 LC-MS 流動相中添加螯合劑,如 EDTA、檸檬酸、乙酰丙酮或甲膦酸。然而,螯合劑會抑制離子並且可能難以從 HPLC 系統中去除。眾所周知,螯合劑會腐蝕不銹鋼。”
UPLC 和 uHPLC 系統的最新迭代通過屏蔽 HPLC 系統和色譜柱流路中的活性位點,使它們無法被分析物接觸,從而完全消除了這些問題。
“基於乙烯橋接矽氧烷聚合物的混合表面技術通過形成有效屏障來防止分析物分子與儀器和分析柱的金屬表面接觸來實現這一點,”Karafilidis 說。