LC-MS 樣品製備中的固相萃取
不出所料,樣品製備方法取決於樣品和最終的分析模式。對於串聯液相色譜 (LC)-質譜 (MS) 方法,基於濃縮、捕獲、過濾、吸附/親和和流通的樣品製備可在目標分析物中富集樣品,同時去除可能干擾 LC 和多發性硬化症。
代謝組學研究在樣品製備過程中面臨著一些最艱鉅的挑戰,尤其是在必須滿足兩種方法(LC 和 MS)的要求時。當一個目標或其分子類別已知或屬於一個一般類別時,例如蛋白質/肽或基因/寡核苷酸,人們至少可以對位置、普遍性和濃度做出有根據的猜測。對於代謝物而言,情況並非總是如此,在從頭或非靶向代謝組學中也並非如此。
幾乎所有分子量低於 1500 Da 的代謝產物或中間體都屬於代謝物,包括碳水化合物、脂質、萜烯、氨基酸、維生素、基因或蛋白質片段——任何東西。在231 種最常見的代謝物中,濃度動態範圍約為 100 萬,但這僅說明了這個特定故事的一部分。對於所有代謝物,差距擴大到 10 14,當典型的代謝組學實驗可能檢查六個目標時,這變得更具挑戰性。
再加上代謝組學不斷變化的擔憂,隨著各種物種的濃度根據生物體的代謝活動而上升和下降,很明顯為什麼代謝組學在得出可行結論方面是迄今為止最難的“組學”。
答案:固相萃取
液相色譜-質譜 (LC-MS) 和核磁共振波譜 (NMR) 是兩種主要的代謝組學方法。核磁共振在每個樣品的基礎上既快速又便宜,樣品製備很簡單或不存在;LC-MS 提供更廣泛和更深入的代謝物覆蓋範圍、更高的靈敏度以及更高的儀器可負擔性和可訪問性,但代價是樣品製備過程的複雜性顯著增加。
無論終點分析方法如何,固相萃取 (SPE) 已成為一種快速、可重現、通用的替代更傳統樣品製備方法的方法,尤其適用於 LC-MS 工作流程。SPE 在小柱中使用標準色譜樹脂來濃縮目標物、清除污染物或乾擾物質,並按分子類別分離目標物。將 SPE 視為“微量色譜法”。
任何適用於常規柱色譜的樹脂和溶劑系統都適用於 SPE。數十種獨特的樹脂以 SPE 形式在市場上出售,還有數百種可以通過家庭釀造獲得。研究人員將它們用於各種可能的分離,包括通過親和、離子交換、HILIC、反相和混合模式進行純化/淨化。
標準化工作流程
在非靶向代謝組學中,首先使用冷甲醇將樣品冷卻至 -80°C,以淬滅代謝活動並將樣品冷凍至其代謝狀態。“嘗試使用任何簡單的提取方法提取所有代謝物本身就很困難,但由於代謝物的理化特性非常廣泛,這變得更加困難,”安捷倫學術和政府/生命科學研究部門市場總監 Steve Fischer 說技術。“研究人員通常使用單相液體萃取從細胞碎片中去除可溶性代謝物部分。然而,當使用這種方法時,由於復雜基質引起的離子抑制,代謝物回收率通常顯示出較差的重現性。”
對於極性代謝物,HILIC 液相色譜和電噴霧電離、質譜已成為首選方法。“LC-MS 分析在正離子和負離子模式下進行,”Fischer 補充道。“通常情況下,對同一樣品進行兩次單獨的運行,因為用於鹼性和酸性代謝物分離和 MS 電離的最佳流動相 pH 值大不相同。”
脂質組學(代謝組的脂質部分)最好使用反相 LC,在流動相中使用兩種或多種有機溶劑。然後通過正離子和負離子模式 LC-MS 分析樣品。與極性代謝物不同,流動相 pH 通常不是脂質分離或正負模式電離的重要因素。然而,正負離子極性存在強烈的脂質類響應差異,因此需要使用兩種離子模式。
由於這些挑戰,研究人員已轉向選擇性代謝物回收,即使用液-液萃取或 SPE 方法將代謝物分離為極性和非極性部分。對於液-液萃取,這涉及使用兩種不混溶的溶劑,其中目標極性代謝物最好留在水相中,而非極性代謝物在有機相中。
或者,固相萃取將通過保留非極性成分同時允許極性代謝物流過來分離極性和非極性代謝物。“與液-液萃取相比,SPE 的優勢在於更好的重現性、對樣品基質變化的更大容忍度、更少的勞動力和完成時間,以及更容易滿足高通量需求的自動化,”Fischer 告訴 Biocompare。已開發出高選擇性 SPE 產品,例如 Agilent Bond Elut 脂質萃取,可以選擇性地保留樣品中的脂質(一種進口代謝物亞類)。
除了簡化分析之外,樣品製備還可以減少 LC-MS 離子源中的離子抑制。一些 LC-MS 電離技術比其他技術更不容易受到離子抑制,但它們都不能完全不受抑制。離子抑制是由樣品基質中與分析物共流出的大量化合物引起的現象。這裡的底線是離子抑制會降低靈敏度,這在尋找低豐度代謝物時很重要。
“沒有任何 LC-MS 離子源可以完全電離所有東西並且沒有離子抑制,”Fischer 說。“此外,將復雜的未製備樣品送入 LC-MS 會污染離子源。研究人員已經嘗試了流動注射 LC-MS 分析,但來自已經相當乾淨的樣品 – 低基質樣品,例如細胞培養物。但即便如此,離子抑制仍然是一個問題。對於更複雜的樣品,研究人員需要進行樣品製備或使用 2D-LC 色譜來改善目標與不需要的基質乾擾的分離,並最終獲得可重現的準確結果。”
爭論自動化
LC-MS 的代謝組學樣品製備涉及許多不確定性,這些不確定性共同影響了重現性和一般數據的可信度。因此,可以輕鬆實現 SPE 自動化,特別是在研究項目的早期,以消除與手動操作樣品和分析資產相關的變量。
正如 Aurora Biomed 的產品專家 Anis Fahandej-Sadi 解釋的那樣,自動化 SPE 的好處幾乎在任何吞吐量下都是顯而易見的。“當我在阿爾伯塔大學學習時,自動化通常用於樣品處理,大多數質譜儀、色譜儀和 NMR 儀器使用自動進樣器。自動化不僅允許更多的無人值守時間,還能讓工人解放出來,提高科學生產力。你不想要博士學位。科學家做技術人員能做的事情。”
例如,為下一代測序準備文庫通常涉及在多重實驗中為每個孔多次轉移 1 到 2 微升試劑和/或樣品。“在這些數量上,小錯誤會產生大後果,”Anis 說。“即使您每天只運行 10 或 20 個樣品,自動化也能收回成本。” 他補充說,讓實驗室工作人員能夠解決更複雜、更需要腦力的問題,“可能會花錢,但從長遠來看,將為您的研究團隊或公司提供更多增值機會——即使是在學術團體中。”
文章作者-Angelo DePalma