成功色譜柱的六大建議
柱層析是一種成熟的技術,適用於從復雜混合物中純化重組蛋白、單克隆抗體和其他生物分子。為了實現這一點,相關的結合夥伴被固定在瓊脂糖珠上,然後將其裝入柱子中作為親和樹脂。一旦目標目標被捕獲到珠子上,就可以將其洗脫以進行進一步的下游分析。為了使該方法成功,色譜柱的裝填和正確運行至關重要。本文討論了實現這一目標的有效方法,並強調了選擇壓力而不是重力進行分離的優勢。
通過包裝您自己的色譜柱來降低成本
儘管市售有多種預裝柱,但通過購買以鬆散樹脂形式提供的專用親和樹脂來裝填自己的色譜柱通常更具成本效益。一定要選擇合適的樹脂來結合您的目標(例如穀胱甘肽瓊脂糖樹脂從細胞培養基中純化 GST 標記的蛋白質,蛋白 A 瓊脂糖樹脂從血清中純化抗體)並查看產品數據表以了解樹脂的結合能力,因此所需的珠子體積,以及樹脂可以承受的壓力。
選擇合適的列
在選擇用於內部裝填的空柱時,請考慮您將使用的純化技術類型。雖然低壓色譜柱通常適用於手動純化方法,但依賴快速蛋白質液相色譜 (FPLC) 設計系統的純化將需要能夠承受更高壓力的色譜柱。窄柱通常比寬柱允許更高的壓力,但可達到的最大流速不僅取決於柱直徑,還取決於緩衝液粘度。
避免引入氣泡
氣泡對柱層析來說是災難性的,它會阻塞樣品流並需要重新開始整個過程。這不僅會浪費時間,還會導致材料的大量損失。為避免在裝柱時引入氣泡,將樹脂和任何緩衝液置於室溫並在使用前至少脫氣 30 分鐘。輕輕搖動珠子將確保它們在添加到柱子之前是均勻的懸浮液,同時將它們慢慢倒入柱壁對於實現均勻分佈至關重要。切勿使用移液器添加珠子,因為移液器很容易堵塞。
定期檢查柱效
在開始純化過程之前以及在運行之間檢查色譜柱性能以確認珠床的完整性沒有變化非常重要。有幾種方法可以做到這一點,最常見的是將示踪物質通過色譜柱以確定理論塔板數和峰對稱性。影響柱效的關鍵參數包括緩衝液粘度、瓊脂糖珠直徑、柱直徑、柱壓和流速。
確定樣品結合的最佳條件
各種因素都有可能影響目標與瓊脂糖珠的結合。因此,在進行柱色譜程序以優化 pH、溫度或鹽/離子濃度等參數以適合您的特定生物分子之前,先進行文獻檢索會很有幫助。例如,在較低溫度下工作並在緩衝液中添加蛋白酶抑製劑有助於最大程度地減少蛋白質降解,同時在將樣品加入色譜柱之前用結合緩衝液 1:1 稀釋樣品是保持適當離子強度和 pH 值以獲得最佳效果的有效方法捆綁。
考慮使用 FPLC 代替重力流方法
儘管無需專業儀器即可輕鬆執行重力流柱色譜,但與 FPLC 相比,它受到勞動強度更大的工作流程、明顯更長的時間和較差的重現性的限制。重力流系統還會增加珠子變乾的風險,例如,如果塞子蓋失效或最終用戶被意外叫離色譜柱。
相比之下,通過採用預編程的方案和無人值守的方法,FPLC 在柱填充和色譜分離過程中提供了對流速的極其嚴格的控制,轉化為高度可重現的性能。FPLC 的其他優點是其較寬的流量範圍使其與許多不同的色譜柱類型兼容,並且還允許多個色譜柱並行運行。此外,FPLC 可以輕鬆連接到其他在線儀器,以進一步簡化工作流程。
Agarose Bead Technologies (ABT) 為柱層析應用提供範圍廣泛的高質量瓊脂糖珠。可以在此處找到更多信息。
作者-艾瑪·伊斯特霍普
Emma Easthope 是位於英國的 Cambridge Technical Content Ltd 的創始人兼董事。自 2000 年從坎特伯雷肯特大學獲得生物學學士學位以來,她在包括 Millennium Pharmaceuticals、阿斯利康和 Cellzome。她現在製作範圍廣泛的科學內容,包括 Biocompare 的常規功能。