選擇完美的 HPLC 管柱
高壓液相色譜 (HPLC) 是分離複雜異質樣品中生物分子的最常用方法之一。將樣品施加到緊密填充的顆粒柱(也稱為填充材料、樹脂或固定相)上。樣品中的分子與溶劑(也稱為流動相)一起穿過色譜柱。由於與流動相和固定相的相互競爭,不同的樣品分子會在不同的時間離開色譜柱——這是每個分析物特有的特性。
當然,這個過程的關鍵是色譜柱本身。但是種類太多了,選擇一個列可能會讓人眼花繚亂。這些指南應該可以幫助您做出正確的選擇。
分離方式
選擇色譜柱的第一個任務是選擇分離化學。有 多種分離分子的方法,其中應用最廣泛的方法包括反相、正相、親水相互作用、離子交換和尺寸排阻 HPLC。還有一些不太常見和更專業的分離模式,例如使用手性固定相或流動相的特定手性色譜。
PerkinElmer色譜技術負責人 Jason Weisenseel 說,反相色譜柱通常用於非極性或弱極性有機化合物,含有非極性固定相(如 C18),通常與極性流動相配對。該方法不應用於蛋白質,Weisenseel 警告說:“流動相,通常含有低 pH 值的乙腈或甲醇,可能會使蛋白質變性,因此要么產生人為峰,要么導致蛋白質聚集和色譜柱堵塞。”
Weisenseel 說,正相 HPLC——其中柱填料是極性材料,如矽膠,流動相是非極性的——是“反相的反相”。它通常用於分離極性分子。
其他流行的模式包括用於分離離子化合物的離子交換 HPLC和按分子大小或形狀分離分子的尺寸排阻色譜 (SEC)。GE Healthcare Life Sciences研究和應用市場的研究員 Åke Danielsson 說,用戶可能會選擇後者來將蛋白質聚集體與蛋白質單體分離,但選擇前者將磷酸化蛋白質與其非磷酸化形式分開。
柱長
確定列類型後,請考慮其長度。理想的長度在某種程度上取決於您的特定樣品和分離模式。但是,一般的經驗法則(和權衡)是更長的色譜柱需要更長的運行時間,但會產生更好的分離效果。Thermo Fisher Scientific 的科學顧問 Tony Edge 說,關鍵是“選擇能夠在分辨率和分析時間之間取得良好平衡的色譜柱長度” 。Edge 說,一個常見的錯誤是使用您在之前實驗中熟悉的一種類型的色譜柱,並將其應用於新類型的實驗,而沒有考慮它的長度是否合適。
Danielsson 表示,柱長(有時稱為“床高”)對於根據大小分離蛋白質尤為重要。“300 毫米的床高是高分辨率蛋白質 SEC 的不錯選擇,”他說。“對於與蛋白質相關的其他分離模式,可以使用更短的色譜柱,例如大約 50 毫米的床高。”
色譜柱顆粒的大小和類型
HPLC 柱床由直徑通常為 2 至 10 μm 的球形功能顆粒構成。據 Weisenseel 稱,標準 HPLC 系統最常見的尺寸為 3 和 5 μm。“對於更複雜的樣品,通過使用 3 微米粒徑的色譜柱可以提高分辨率,”他說。小於 2 μm 的粒徑用於超高效液相色譜 (UHPLC),這是一種特殊形式的 HPLC,使用比 HPLC 更小的顆粒和更高的壓力。
與 HPLC 中的所有內容一樣,色譜柱屬性代表了一種權衡。一般而言,較小的粒徑可提供更高的分辨率 – 需要注意的是,背壓也更大,以便將流動相泵送通過密度更大的色譜柱。不出所料,“填充較小珠子的色譜柱更容易堵塞,”丹尼爾森說。
除了珠子尺寸,用戶通常還可以選擇製作它們的材料。流行的選擇包括二氧化矽、羥基磷灰石和交聯聚合物樹脂。常見的疏水性烷基鏈的長度為 C4、C8 和 C18。通常,材料對感興趣的分析物具有一定程度的選擇性——做出這種選擇對於優化分辨率很重要。例如,C18 更常用於分離肽或小分子,而 C4 更適用於蛋白質。“選擇性對分辨率的影響比珠粒大小的影響更大,”丹尼爾森說。“因此可以通過改變選擇性來顯著提高分辨率”,例如,通過在用於 SEC 的顆粒中使用不同的孔徑或通過“在離子交換色譜中使用季胺配體代替 DEAE [二乙氨基乙基]”。
顆粒的化學性質也會影響蛋白質的分離。Danielsson 說矽膠上的矽烷醇基團是一種常見的柱填充材料,可以非特異性吸附蛋白質。表面塗覆的二氧化矽在一定程度上緩解了這種情況,但受損的顆粒仍然可以吸附蛋白質。此外,矽膠填料不能耐受蛋白質分離中常用的標準、高 pH 清洗方案,Danielsson 說,他補充說,“基於瓊脂糖的固定相表現出低的非特異性蛋白質吸附,並能耐受高 pH 柱清洗方案。”
技術調整也產生了新的粒子類。一種稱為表面多孔顆粒 (SPP) 或核殼顆粒的新型二氧化矽基材料有望實現通常僅來自亞 2 微米顆粒但沒有更高壓力的分辨率。通常,常規顆粒小於 2 μm 的 HPLC 色譜柱需要專門的 UHPLC 泵和/或系統來處理更高的背壓。與球形且完全多孔的傳統二氧化矽顆粒不同,“SPP 顆粒由塗有多孔二氧化矽殼的實心二氧化矽核組成,”Weisenseel 說。“這些顆粒的優點是它們表現出類似於亞 2 微米顆粒的效率,顆粒尺寸為 2.6 微米及以上,但在背壓略高於一半的情況下運行。”
吞吐量
如果吞吐量是一個問題,請注意色譜柱設計。“使用較短的色譜柱會減少總分析時間,但也會影響分辨率,”Edge 說。Danielsson 說,對於高分辨率 SEC 分離,建議使用 300-mm 色譜柱,但通過使用 150-mm 色譜柱進行篩選可以提高總通量。
儘管如此,HPLC 通常不是分離研究的瓶頸,Weisenseel 指出——它是樣品製備。“您可以減少樣品製備以提高通量,但臟樣品會導致更多的 HPLC 維護和停機時間,這也會對您的通量產生不利影響,”他說。“良好的樣品製備是獲得一致和可靠結果的關鍵因素。” 最終,將您最好的樣品與最合適的 HPLC 色譜柱相匹配將產生最高質量的結果。