萊克多巴胺/瘦肉精檢測方式
萊克多巴胺(ractopamine,RAC)是人工合成的β-腎上腺受體激動劑,屬於“瘦肉精”的一種,可以同時提高動物的日增品質,提高飼料利用率,提高動物的蛋白質含量。目前只有美國、加拿大、巴西等24個美洲和亞太地區允許將萊克多巴胺用於食用性動物(主要用於豬和牛)的促生長和提高瘦肉率。萊克多巴胺屬於激素類添加劑,而激素類飼料添加劑用於動物後,具有激素殘留的問題,對動物機體產生副作用,同時也會影響消費者的健康。歐盟早已明確禁止在食用性動物中使用包括萊克多巴胺在內的所有β-腎上腺素興奮劑類藥物(歐盟96/22/EC法令)。
檢測方式
1.免疫分析方法
免疫分析方法是利用抗原與抗體特異性反應為基礎的分析技術,主要包括酶聯免疫法、膠體金免疫層析法、螢光微球免疫層析技術和時間分辨螢光免疫分析技術等。
1)酶聯免疫法
酶聯免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是基於競爭性酶聯反應原理,把抗原-抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機結合起來的一種檢測技術,目前廣泛應用於萊克多巴胺殘留的檢測。ELISA法檢測動物性食品中的萊克多巴胺,最低檢測限可達0.1ng/mL,平均回收率在70%~90%之間。ELISA 法具有快速、靈敏和高通量等特點,且無需昂貴的儀器,是目前基層檢測部門應用的主要方法,一般用來進行大批量樣品的初步篩選,但該方法穩定性差,出現的假陽性較多,需用氣相質譜或液相質譜進行確證。
2)膠體金免疫層析技術
膠體金免疫層析技術(gold immunochromatographyassay,GICA)是近年來興起的一種快速檢測技術,該技術是一種將膠體金顆粒與包括抗原、抗體在內的許多蛋白質標記形成免疫金複合物的技術。基於膠體金免疫層析法研製出的試紙條,可在8~10min內完成萊克多巴胺測試,檢測限為5ng/mL,肉眼即可判斷[10]。膠體金免疫層析技術具有簡單、快速、特異、靈敏的特點,不需要借助相關儀器,檢測效率能得到很大提高,適合大規模樣品的現場檢測。
3)螢光微球免疫層析技術
螢光微球免疫層析方法比膠體金免疫層析方法具有更高的靈敏度。劉道峰等[11]以螢光微球為新型標記物,採用EDC法進行偶聯,製備了萊克多巴胺抗體螢光微球複合物,並以之為探針對萊克多巴胺進行檢測,檢測限為2.5ng/mL,且特異性強、檢測範圍寬。
4)時間分辨螢光免疫分析技術
時間分辨螢光免疫測定(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一種非同位素免疫分析技術,它用鑭系元素標記抗原或抗體,根據鑭系元素螯合物的發光特點,用時間分辨技術測量螢光,同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨,可有效地排除非特異螢光的干擾,極大地提高了分析靈敏度。TRFIA作為一項新興的超微量標記免疫技術,其靈敏度比ELISA法更高、穩定性更好,目前已有其應用於萊克多巴胺檢測的報導。
2.色譜分析技術
色譜分析技術是萊克多巴胺檢測中常用的定量和確證方法,主要包括高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)和液相色譜-質譜法(HPLCMS)等。
1)高效液相色譜法
萊克多巴胺的HPLC法檢測主要是採用SPE固相萃取小柱淨化,二極體陣列檢測器(diode array detector,DAD或螢光檢測器(fluorescence detector,FLD)檢測。由於萊克多巴胺的紫外最大吸收波長在224nm左右,採用HPLC-DAD對萊克多巴胺進行檢測時,在此波長附近干擾較大,通常不採用DAD檢測器檢測。萊克多巴胺含酚羥基,具有螢光性,可採用FLD檢測器測定,激發波長約為226nm,發射波長約為305nm,該方法靈敏,檢出限可達0.3μg/L,同時可排除雜質干擾。
2)氣相色譜-質譜法
萊克多巴胺化學結構中具有不易氣化的羥基和氨基,屬於高沸點、難揮發的化合物,衍生後才能測定。常用的衍生劑有BSTFA(雙三甲基矽烷基三氟乙醯胺)和BSTFA+1%TMCS(三甲基氯矽烷),衍生溫度為80℃左右,衍生時間為1h。採用GC-MS對豬肝臟中萊克多巴胺檢測的檢出限和定量限分別為0.5ng/g和2.0ng/g,對豬尿的檢出限和定量限分別為0.3μg/L和1.0μg/L。GC-MS是萊克多巴胺檢測最常用的定量和確證方法,但是它需要衍生,衍生效率對測定結果影響很大,因此加標回收率不高,同時衍生劑和甲苯有極強的毒性。
3)液相色譜-質譜法
液相色譜-質譜法不需要衍生,採用內標法定量,在提高效率的同時提高檢測的準確度,採用UPLC-ESIMS-MS對牛肉中的萊克多巴胺的檢出限和定量限分別為0.07μg/kg和0.22μg/kg。液相質譜法靈敏度高,重現性強,適用於萊克多巴胺的確證檢測,但是其分析成本昂貴,難以普及。
3. 感測器技術
1)生物感測器技術
近年來,表面等離子體共振(SPR)生物感測器受到人們的關注,原理為將能夠與待測物結合的物質固定在感測器晶片上,當待測物流過晶片表面時與晶片表面的物質結合,引起晶片表面光學參數變化,並以電信號的形式表現出來。該技術可在15min內完成單個樣品的萊克多巴胺檢測,檢出限達0.6μg/kg。
該技術無需對分子進行標記,方法的建立和樣品預處理簡單,所需樣品量少,可利用動力學特性繪製標準曲線,檢測時間短,可分析弱相互作用或瞬間相互作用,可即時檢測。
2)電化學感測器技術
採用Nafion-Au-Nafi on修飾玻碳電極,建立了萊克多巴胺的迴圈伏安電化學傳感方法,在pH2.0、B-R為支援液、富積時間120s、掃描速度50mV/s、電位1.1V條件下,檢測限可達2μg/L,檢測時間不超過5min。
4. 分子印跡技術
分子印跡技術的原理是:當範本分子(印跡分子)與聚合物單體接觸時會形成多重作用點,通過聚合過程這種作用就會被記憶下來,當範本分子除去後,聚合物中就形成了與範本分子空間構型相匹配的具有多重作用點的空穴,這樣的空穴將對範本分子及其類似物具有選擇識別特性。分子印跡技術具有預定性、識別性和實用性等特點,目前廣泛應用於色譜技術(固相萃取前處理)、酶聯免疫技術、電化學感測器技術中,對動物性食品中的萊克多巴胺進行檢測。
5. 光譜技術
近年來,光譜技術用於鹽酸萊克多巴胺的檢測也有了新的進展,主要是表面增強拉曼光譜技術和太赫茲時域光譜。將表面增強拉曼散射光譜(SERS)用於豬尿中萊克多巴胺的檢測,樣品中的萊克多巴胺採用液液萃取LLE)和液液萃取-固相萃取(LLE-SPE)兩種方式提取後分別進行SERS檢測,檢測限分別為0.8μg/mL和0.4μg/mL。SERS技術測量樣品的製備方法簡單,具有很大的潛力,可用於快速分析的豬尿中萊克多巴胺。
6.化學發光法
根據鹼性介質中萊克多巴胺對魯米諾-鐵氰化鉀體系化學發光的增敏作用,建立了新的流動注射-化學發光快速測定萊克多巴胺的方法,相對發光強度與萊克多巴胺品質濃度在0.004~0.8μg/mL範圍內呈良好的線性關係,檢出限為2.5μg/kg。
參考文獻-石晶,王毅謙,吳福平,郭暘.動物性食品中萊克多巴胺檢測方法研究進展[J].肉類研究,2013,27(04):44-47.