ELISA 檢測策略

當 ELISA 於 1971 年首次在文獻中描述時，它使用抗體包被的珠子從溶液中捕獲酶標記的抗原，並且具有費力的手動工作流程。ELISA 從此成為一種基於平板的完全自動化技術，採用多種檢測策略——每種策略各有優缺點。

選擇正確的格式

現代的基於平板的 ELISA 可以通過四種主要方式之一進行配置。“在直接 ELISA中，板塗有抗原，標記的一抗用於檢測，”Boster Bio 營銷和銷售副總裁 CJ Xia 解釋道。“間接 ELISA類似，但結合了未標記的一抗和標記的二抗，可以提供信號放大。在夾心 ELISA過程中，將板塗上抗原特異性抗體，然後使用不同的抗原特異性抗體檢測結合的抗原。所有這些測定都可以轉化為競爭性 ELISA，其中樣品抗原與標記的參考抗原競爭抗體結合。”

在不同類型的 ELISA 之間做出決定很大程度上取決於您的研究目的。直接 ELISA 通常用於監測抗體：抗原相互作用，例如在過敏測試期間或用於檢查抗體交叉反應，而間接 ELISA 非常適合確定樣品中的總抗體濃度。夾心 ELISA 因其高特異性和靈敏度而可用於分析複雜樣品類型，例如血漿或血清，而競爭性 ELISA 提供了一種研究只有一個表位可用於抗體結合的小抗原的方法。

Cytiva 戰略技術合作夥伴關係和客戶關係全球總監 Fredrik Sundberg 報告說，夾心 ELISA 通常是首選形式。“雖然夾心 ELISA 通常需要更多優化來識別匹配的抗體對並確保捕獲抗體和檢測抗體之間的交叉反應最小，但它比僅使用一種抗體進行抗原識別的 ELISA 格式具有更高的特異性，”他說。“出於這個原因，夾心 ELISA 在從早期藥物發現研究到生物製藥製造和臨床測試的應用中很受歡迎。”

定性分析還是定量分析？

除了選擇合適的 ELISA 格式外，研究人員還應考慮所需的數據輸出類型。Bio-Rad Laboratories 免疫測定全球產品經理 Vanitha Margan 指出，ELISA 結果可以是定性、半定量或定量的。“ ELISA 數據的定性解釋僅涉及通過與不含目標抗原的空白孔進行比較來確定樣品中是否存在抗原——這是一個是或否的答案，”她說。“相反，半定量分析提供了測定中不同樣品中抗原水平的相對比較，因為信號強度將直接隨抗原濃度變化。定量期間分析，將已知濃度的抗原連續稀釋以產生S形標準曲線，然後通過與曲線的線性區域進行比較來計算未知樣品的濃度。

根據您的研究性質，您可能希望先進行定性或半定量 ELISA，然後再切換到定量方法。例如，定性 ELISA 可以幫助確定適合化合物篩選目的的樣品類型，然後定量 ELISA 可用於根據所選樣品材料中的活性對潛在的小分子候選藥物進行排名。

選擇讀數

ELISA 讀數是另一個需要考慮的重要因素。“在研究環境中，比色檢測是最常見的，因為分析開發相對簡單，不需要專門的儀器，”Xia 評論道。“然而，當需要高靈敏度時，基於化學發光、電信號或 qPCR 的檢測方法可以將靈敏度提高多達 1,000 倍。” 多重 ELISA 在基於平板時通常使用化學發光或熒光檢測，而對於基於珠子的應用（例如 Luminex xMAP ^®技術）則使用熒光。

選擇讀數時，適應所選方法的任何獨特特性至關重要。例如，基於熒光的 ELISA 需要使用黑色微孔板來消除串擾，而化學發光 ELISA 則必須解決底物耗盡的問題。“在化學發光檢測過程中，光發射僅發生在酶-底物反應期間，”Sundberg 解釋說。“因此，當底物耗盡時，信號就會停止。如果運行大量板，研究人員應在讀取前採取措施防止信號衰減。” 對於使用比色檢測的 ELISA，在定義的時間點添加終止溶液將防止反應過度發展。

復用還是不復用？

另一個關鍵決定是是否對 ELISA 進行多重分析。“對於樣品量和時間有限並且想要在同一孔中測量多個蛋白質靶標的研究人員來說，多路復用是可行的方法，”Margan 說。“為了說明這一點，測量 38 個樣本中的 48 種細胞因子需要 48 個 96 孔板，超過 106 小時，並且每個樣本需要超過 1 毫升的常規 ELISA。另一方面，使用 Bio-Plex Multiplex 系統——一種基於 Luminex xMAP ^®技術的微珠平台——同一位研究人員只需要一個 96 孔板、3 小時和低至 12.5 µL 的樣品。”

Bio-Plex 多重分析與傳統 ELISA 的比較。圖片來自 Bio-Rad。

“多重 ELISA 可以成為發現研發特別有價值的工具，在早期測量幾種感興趣的蛋白質通常會提供更多信息，”Sundberg 評論道。“然而，由於目標通常以非常不同的濃度存在於樣品材料中，因此大範圍內的線性對於可靠數據至關重要。”

現成的還是自己做的？

決定 ELISA 檢測策略時要考慮的最後一個因素是是購買現成的試劑盒還是自行開發檢測方法。對於單重檢測，很可能會提供商業試劑盒，但 Xia 告誡不要購買在線搜索中出現的第一個產品。“當您需要 ELISA 試劑盒，而您根本找不到一家您知道可以提供該試劑盒的合法公司時，不要急於從聲稱擁有針對其產品組合中超過 10,000 個目標的試劑盒的公司購買，”他說。“任何開發過 ELISA 的人都知道，想出這麼多產品是不可能的。至少，如果您決定花費 700-1000 美元購買這樣的試劑盒，請使用試劑盒中的檢測抗體進行蛋白質印跡，並確保條帶以正確的分子量顯示。

如果您選擇走 DIY 路線，則不妨考慮將流程的一部分外包出去。“開發 ELISA 是一項勞動密集型工作，需要專業知識，”Sundberg 報告說。“因此，將一抗和二抗生產甚至整個開發過程外包給成熟的供應商或服務合作夥伴的趨勢越來越明顯。如果您需要過程特定的 ELISA，例如在後期臨床階段測試過程和產品再接種的雜質，如宿主細胞蛋白或蛋白 A，外包 ELISA 開發可能特別有益。與使用現成的產品相比，它不僅可以確保更高的特異性和靈敏度，而且還可以保障長期供應，這可能需要 10 年甚至更長時間。”

文章作者-Emma Easthope

Emma Easthope 是總部位於英國的 Cambridge Technical Content Ltd 的創始人兼董事。自 2000 年從坎特伯雷的肯特大學獲得生物學學士學位以來，她在包括 Millennium Pharmaceuticals、Millennium Pharmaceuticals、阿斯利康和 Cellzome。她現在製作範圍廣泛的科學內容，包括 Biocompare 的常規功能。