PCR 故障排除指南

PCR 是幾乎每個使用分子生物學的實驗室中無處不在的部分，無論是用於克隆的標準端點 PCR、用於基因表達研究的定量逆轉錄 PCR (qPCR)，還是用於尋找基因針的數字 PCR (dPCR) -草垛。雖然實驗室中的大多數人在理論上都熟悉 PCR，但在實踐中並不總是按照預期進行。本文介紹了 PCR 可能出現的一些問題、可能導致這些問題的原因，並提供了一些故障排除技巧。

污染——回歸基礎

在 Covid-19 大流行期間，沒有 PCR 經驗的人湧入醫學診斷領域，凸顯了 PCR 污染的挑戰。同一目標先前擴增的遺留物、實驗室中發生的其他反應的交叉污染、其他樣品的污染，甚至環境中的外源 DNA 的污染，都可能導致不准確的結果，包括假陽性。

一些“良好實驗室規範”工作流程解決方案可以提供幫助。例如：切勿在設置反應的同一空間中分析或打開反應。使用使 DNA 無法擴增的漂白劑等溶液對錶面進行淨化（乙醇無效）。穿戴乾淨的防護裝備，包括新手套。

在診斷性 PCR 中也普遍使用酶溶液來防止假陽性。例如，DNA 殘留預防技術將 dUTP 結合到 PCR 反應中，將不耐熱的尿嘧啶脫氧糖基化酶（UNG 或 UDG）添加到後續的預混液中，以在這些擴增子用作模板之前對其進行降解。dTTPs 不受影響，UNG 在 PCR 的第一步中被滅活。

富含 GC 的模板

為使 PCR 最成功，引物應與模板唯一結合，具有相似的解鏈溫度，並且不與自身或其他引物結合。對其他人已成功使用的引物進行快速文獻搜索是尋找引物序列和檢測條件的良好開端。如果您的序列是獨一無二的，請通過引物設計軟件運行它以提供在大多數常規擴增中可行的建議。

然而，富含 GC 的靶標——鳥嘌呤-胞嘧啶鹼基對超過 60% 的靶標——往往不是常規的。它們更有可能形成複雜的二級結構，與這些靶標雜交的引物更有可能二聚化。並且由於三個氫鍵連接一個 GC 對，與兩個連接的 AT 對相比，富含 GC 區域的熔化溫度按比例高於平均值。

對富含 GC 的目標以及一般的複雜目標執行成功的 PCR 往往需要更多優化。例如，較高的解鏈溫度意味著較高的退火溫度以避免非特異性結合。每個循環形成的產物較少，因此需要更多的循環。過於嚴格的條件會導致根本無法形成任何產品。研究人員通常會使用梯度進行測試運行以確定理想的循環溫度。

許多其他參數也可能需要優化，包括變性時間和引物以及 MgCl ²⁺濃度。添加劑還可以幫助改善複雜目標的擴增，通常是減少二級結構或減少非特異性引物結合。這些也可以通過梯度進行優化，但參數太多，過程可能會很乏味。與其調整每一個，不如從包含此類添加劑且專為擴增富含 GC 的目標而設計的預混液開始。通常也推薦使用更具加工性的聚合酶。

一個好的模板

雖然在不應該出現的條帶上看到條帶，或者在條帶應該出現的地方出現條紋或污跡令人不安，但在條帶上什麼也看不到也同樣令人不安。最明顯的原因是一個簡單的否定結果——樣本中不存在被查詢的序列——但也有許多其他可能的解釋。

要問的第一個問題是陽性對照——通常是已知在特定水平表達的管家基因，或加入已知包含感興趣序列的模板的樣本——是否產生預期結果。如果不是，問題可能出在檢測本身。但是，如果陽性對照確實呈陽性，則實驗樣本很可能不包含感興趣的可擴增序列。那麼問題就變成了它是一個簡單的陰性結果還是由於樣本是如何（或何時）採集和準備的。

例如，直接來自土壤或血液等粗樣品並含有腐殖酸或血紅蛋白的不純模板可能對 PCR 造成問題。它們可能含有核酸酶，最終會降解 DNA、抑製劑或鹽。確保樣本良好的最簡單方法之一是檢查 DNA 的 A260/A280 吸光度比是否約為 1.8（RNA 約為 2.0）。如果該比率偏離該比率很遠，則（重新）純化 DNA，確保對樣品使用正確的試劑盒或方案。或者使用更少（如果開始時足夠濃縮）樣品來稀釋雜質，請記住，更大的基因組需要更多的 DNA 以確保至少有一個感興趣基因的可擴增拷貝。另一種選擇是使用數字 PCR (dPCR)，它對雜質的容忍度更高。

問題也可能出在實驗本身。例如，錯誤的分析時間點可能會導致負面結果。嘗試運行一個時間進程，使用足夠短的間隔來捕獲其中一個窗口中的事件。

附表概述了一些常見的有問題的 PCR 結果、可能導致它們的原因以及可能的解決方案。

非常感謝 New England Biolabs 擴增開發組負責人 Gregory Patton 和 Bio-Rad Laboratories 高級應用經理 Angelica Olcott 分享了他們對 PCR 故障排除的見解。

文章作者-Josh P. Roberts

喬什·P·羅伯茨 (Josh P. Roberts) 擁有科學史和科學哲學的碩士學位，並且還攻讀了博士學位。明尼蘇達大學分子、細胞、發育生物學和遺傳學項目，以及眼部免疫學論文研究。