PTM：揭示蛋白質多樣性的另一層

翻譯後修飾 (PTM) 通過向其至少一個氨基酸殘基添加官能團或蛋白質來改變翻譯蛋白質的特性。¹ PTM 還可以在不改變編碼序列 (CDS) 的情況下改變蛋白質表型，從而顯著增加蛋白質多樣性。² Thermo Fisher Scientific 高級研發經理 Ryan Bomgarden 表示，“PTM 可以提供各種化學修飾，用於改變蛋白質的電荷、溶解度、穩定性和結構。各種各樣的 PTM 源於酶的進化，通過其獨特的功能基團修飾不同的氨基酸。” PTM 還涉及與年齡相關的疾病，並作為治療疾病的可能靶點存在。

PTM 檢測面臨的挑戰

由於生物多樣性和技術限制，PTM 仍然難以調查。現有的每個 PTM 都具有不同的化學性質，需要不同的分離方法。⁴這些修飾也可以在低濃度下表達。“雖然 PTM 出現在總蛋白質群的一小部分，但它們的低發生率並不等同於生理無關性。PTM 可以作為微調機制來精確控制蛋白質活性，即使在低濃度下也是如此，”Cytoskeleton 營銷和銷售經理 Henrick Horita 指出。

通過免疫沉澱 (IP) 富集 PTM 修飾的蛋白質

PTM 的低濃度和高多樣性需要使用富集特定 PTM 的方法。IP 代表了最常見的方法，其中可以分離給定蛋白質的所有 PTM 物種或具有特定 PTM 的所有蛋白質。無論哪種方式，Horita 說，“諸如 Cytoskeleton 生產的親和試劑盒包含由抗體或特異性識別 PTM 的結合結構域組成的親和矩陣。” 在檢測 PTM 時，使用的 PTM 富集方法也很重要。安捷倫科技公司生物製藥工作流程經理 Mike Knierman 解釋說，“PTM 富集方法必須小心，不要扭曲 PTM 的回收。例如，在樣品處理中使用高 pH 值的方案可能會因水解而失去磷酸基團，導致天冬酰胺和谷氨酰胺脫酰胺，或重新排列二硫鍵。”

Western blotting：PTM 鑑定的初步方法

蛋白質富集後，準備了一系列技術來進一步表徵 PTM。其中包括蛋白質印跡，這是一種用於分離和檢測蛋白質的基礎分析技術。該技術依賴於特異性標記蛋白質或蛋白質內 PTM 的抗體。雖然它們可用於檢測特定蛋白質中的 PTM，但它們也面臨通量方面的挑戰。“針對特定 PTM 的抗體很難產生，因為可能會發生與天然蛋白質的交叉反應，”Knierman 說。

鄰近連接分析：識別蛋白質相互作用並改進 PTM 檢測

依賴抗體特異性結合感興趣的蛋白質或 PTM 會增加檢測感興趣蛋白質以外的蛋白質的風險。⁵鄰近連接分析通過使用由連接器寡核苷酸序列偶聯的抗體對來緩解這個問題。^6個該技術依賴於滾環擴增 (RCA) 來生成模板的單鏈序列，該序列可以通過基於熒光的測定中的雜交探針進行檢測。Bomgarden 指出，這種檢測的關鍵在於“抗體靶標結合的額外特異性，因為只有當核苷酸連接的抗體足夠接近以進行連接時才會產生信號。” 已經開發了一系列用於基於熒光的定量和可視化的鄰近連接分析，包括 MilliporeSigma 的 DuoLink ^®鄰近連接分析和 Thermo Fisher 的 TaqMan ^TM蛋白質分析開放試劑盒。根據 Bomgarden 的說法，TaqMan 試劑盒“非常靈敏，因為 RT-PCR 用於放大低信號並提供更可重複的 PTM 和蛋白質定量。”

體外試驗：檢測 PTM 活性

體外測定是對蛋白質印跡進行表徵 PTM 的另一種有用補充。這些實驗側重於純化感興趣的蛋白質並確定它們是否包含特定的 PTM。這是通過將蛋白質與特定酶、底物、輔因子和能源一起孵育以研究蛋白質活性來實現的。一些化驗具有一種標記形式來識別磷酸鹽轉移事件。從 ATP γ 位置到肽中的³² P 同位素的放射性標記代表了一種監測給定蛋白質激酶活性的方法。⁷其他檢測，例如時間分辨福斯特共振能量轉移 (TR-FRET)，使用標記磷酸肽或磷酸酪氨酸殘基的抗體來檢測磷酸肽積累和激酶活性。⁸無論採用何種檢測方法，微調方法學參數（讀出技術、蛋白質純化、動力學和熱力學參數以及實驗條件）對於獲得生物學見解至關重要。⁹

質譜法 (MS)：高通量 PTM 表徵

質譜有助於克服蛋白質印跡和其他用於表徵 PTM的體外技術所固有的挑戰。這種方法依賴於電離分子和蛋白質到氣相。“質譜法不需要 PTM 特異性試劑來在單次運行中識別和量化多個 PTM，”Kniermann 補充道。“此外，質譜法比蛋白質印跡技術具有更高的特異性和更好的定量能力。有時用 PTM 分離所有肽片段是有用的，但並不總是必要的。”

許多質譜儀可用於通過這種方法鑑定 PTM，¹⁰包括 Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF 光譜儀。Knierman 這樣說：“該光譜儀具有自下而上和自上而下的 PTM 表徵方法的​​能力。自上而下的方法可以幫助查明蛋白質中 PTM 的位置和關係。自下而上的方法提供了更完整的碎片覆蓋和所有 PTM 的本地化，但可能會丟失 PTM 彼此之間關係的上下文。”

結論

PTM 在多種生物過程中起著關鍵作用。儘管它們很重要，但 PTM 的研究面臨著一些挑戰，包括它們在體內的高多樣性和低濃度。儘管如此，存在許多表徵這些 PTM 的技術。其中一些方法，如蛋白質印跡和體外化驗，可以檢測具有特定 PTM 的蛋白質或蛋白質內的所有 PTM 種類。其他方法可以識別 PTM 活性的變化或識別蛋白質相互作用和修飾。對於高通量 PTM 表徵，質譜法仍然是首選方法。使用哪種協議取決於所提出的研究問題。但有了過多的可用方法，我們有了前所未有的機會來更好地了解 PTM 及其在人類疾病和健康中的作用。

文章作者-Paul Naphtali

Paul Naphtali 擁有理學碩士學位。在麥克馬斯特大學獲得生物學博士學位，他的研究重點是使用下一代測序技術追踪地下水糞便污染。他還獲得了博士學位。麥克馬斯特大學生物化學和生物醫學科學專業，他的論文研究重點是使用生物信息學工具進行基因組註釋、轉錄組學和基於分子的分析來研究囊性纖維化氣道感染。