光片顯微鏡：細胞、組織和整個動物的 3D 視圖

2022 年 12 月 19 日

newpowersadmin

越來越多的科學家正在利用光片顯微鏡，這是一種與共聚焦顯微鏡相似的 3D 熒光成像技術，後者如今廣泛用於細胞、組織和器官的 3D 圖像。然而，這兩種技術之間的明顯差異部分解釋了最近對光片顯微鏡的興趣。“在過去的十年中，光片顯微鏡發展迅速，使研究人員能夠回答共聚焦無法解決或難以解決的問題，”Visikol 首席執行官兼聯合創始人 Michael Johnson 說。本文將探討光片顯微鏡的優勢，並討論其在當今研究中的應用示例，包括類器官和球體等 3D 細胞培養物的成像。

對樣品溫和

在用光成像時，Goldilocks 方法是明智的：光線太少意味著您看不到任何東西，但是太多的光線會對樣品本身造成光損傷，並使您試圖成像的熒光團發生光漂白。光片顯微鏡使用單平面照明，因此只有被成像的 2D 平面被薄薄的光片照亮（相比之下，傳統的共聚焦成像在對一個平面成像時照亮整個樣本）。在這兩種成像技術中，一次對一個焦平面成像，然後計算機將一系列 2D 圖像組合起來構建 3D 圖像。

由於這種照明差異，整個樣品在光片顯微鏡下接收的光線較少，因此更健康。這對於敏感樣本、活體組織或低水平表達的成像目標尤其有價值。“光片顯微鏡是迄今為止最溫和的成像方法之一，因為它減少了光毒性和漂白造成的整體光損傷，”徠卡顯微系統美洲生命科學部共聚焦系統產品性能經理 Haridas Pudavar 說。“這會自動增加標本的生存能力，並使科學家能夠長時間獲得更多與生理相關的數據，例如，在對胚胎髮育進行成像時。”

更快的成像

與共聚焦相比，光片顯微鏡通常更快。“光片顯微鏡使用相機來檢測發射的光，這比共聚焦顯微鏡中的點掃描儀快得多，”Luxendo（Bruker 的一部分）高級產品和應用經理 Monika Löschinger 說。“光片顯微鏡是獲取細胞、類器官和有機體的熒光 3D 堆疊的最快、最溫和的方法，它與全面的環境控制相結合，使長期實驗（長達數天）成為可能，因為光漂白和光毒性顯著降低光片顯微鏡。” 研究快速實時事件的科學家還可以利用光片顯微鏡更好的時間分辨率。“使用靈敏的 sCMOS 相機可實現更高的時間分辨率，而不會影響光學切片能力，”普達瓦爾說。“連同單平面照明，這有助於光片技術實現敏感樣品長時間高速體積成像的能力。”

多種應用

今天的科學家們正在各個領域使用光片顯微鏡。

整個生物體的發育

發育生物學家正在利用光片顯微鏡觀察有機體生命中的早期事件。Löschinger 指出，Bruker Luxendo 的光片顯微鏡平台被用於對小鼠卵母細胞和第一次有絲分裂事件進行成像——這在這些敏感樣品中是一項艱鉅的任務。“這些就像小天后一樣，”她說。“他們不喜歡孤獨，需要一定的環境，你需要對他們非常友善和溫柔。” 發育生物學家還使用 Bruker Luxendo 光片平台的光操縱模塊主動擾亂、操縱和研究果蠅胚胎的組織形態發生。Pudavar 還提到了一些例子，包括斑馬魚胚胎的心跳，以及由 Ca ²⁺離子濃度變化引發的快速生理事件。

清除組織和器官

組織透明化的進展為更多的光片顯微鏡研究鋪平了道路。“只要它是透明的，你可以用光片顯微鏡成像的組織類型沒有限制，”Löschinger 說。“借助透明技術和光片顯微鏡，您可以對整個透明小鼠進行成像，而不會通過切片損壞組織，因此您可以獲得逼真的 3D 結果，用於組織的 3D 微觀結構分析。” 她補充說，這在研究腦組織、分析器官發育以及研究腫瘤的形成和結構方面特別有用。

Johnson 指出，光片顯微鏡非常適合在清除的整個小鼠大腦或其他大型組織中進行快速、大體積、3D 成像。“它非常適合用於標記有熒光蛋白或小化學染料的大組織，因為讓抗體深入組織非常具有挑戰性，”他說。“一些研究人員已經能夠實現深度抗體滲透，但它非常具有挑戰性，而且往往很昂貴，並且需要大量的方法開發和驗證工作。”

3D 細胞培養

3D 細胞培養物，如球狀體和類器官，是研究疾病過程和腫瘤生物學的寶貴模型系統，但它們也帶來了成像挑戰。“這可以通過光片顯微鏡來克服，它允許在合理的時間內跟踪大樣本中的亞細胞變化，”Pudavar 說。“細胞球體模仿實體瘤的特性，非常適合模擬具有生理相關性的癌症發展。” Löschinger 同意，來自不同組織和器官的球狀體和類器官在許多研究領域中變得越來越重要。“光片顯微鏡是在高時間和空間分辨率下研究這些精細樣品的理想技術，”她說。

儘管 3D 細胞培養很重要，但在通常使用多孔板形式的高通量研究中，光片顯微鏡並不經常用於研究它們——事實上，這正是共聚焦顯微鏡仍然非常寶貴的地方。“光片要求照明和成像物鏡彼此正交，這需要使用倒置光片顯微鏡，其中板部分浸沒在成像介質中，物鏡以 45 度角安裝在成像介質中放在盤子下面，”約翰遜說。“這樣的成像系統尚不存在，並且由於許多工程和物理限製而難以開發。” 相反，當今大多數高通量、高內涵成像都依賴於自動共聚焦顯微鏡。

然而，儘管光片顯微鏡目前不適用於多孔板格式，但它已被用於創建篩選模型。例如，徠卡的 DLS 最近被用於開發高通量模型，以測試源自白色脂肪組織的球體的藥物反應性。使用此類模型篩選藥物的機會可能會加速發現代謝和其他疾病的治療方法。