NGS 平台指南

在過去 15 到 20 年間，新一代測序 (NGS) 的發展見證了多種技術迅速跨越彼此的里程碑，以更快、更便宜、更準確地對更多 DNA 進行測序。雖然 Illumina 測序儀仍占主導地位，但其他 NGS 供應商正在取得進展，為測序機制、讀取長度、運行時間、易用性和可擴展性提供重要的替代選擇。本文旨在引導研究人員了解當今常見 NGS 平台之間的主要差異。

短讀測序

NGS測序平台根據測序的DNA片段大小大致可分為短讀長（通常<300個鹼基）和長讀長（約1kb及以上）測序（又稱單分子測序）。過去，短讀長測序的通量和成本明顯高於長讀長測序，但如今——隨著後者的迅速發展——這些決定更多地取決於單個項目及其測序需求。

照明

Illumina 的測序方法使用專有的簇生成過程和帶熒光標記鏈終止子的合成測序。這已成為最廣泛採用和發表的測序方法，有超過 300,000 篇同行評議的出版物。當前 Illumina 平台的最長讀取長度為 2×300，但即將推出的 Illumina ^®Illumina 產品營銷總監 Brooke Murphy 表示，完整的長讀長技術將使研究人員能夠持續生成 6-7 kb 的連續長讀長，最高可達 30 kb。對於當前技術，運行時間可能從幾個小時到 2 天不等，具體取決於研究項目和使用的儀器。“我們的許多儀器可以在一天左右的時間內完成一次測序，”墨菲說。“根據客戶的需求，測序讀取的輸出可以從數百萬到超過 200 億不等。”

與 NGS 平台相比，Illumina 測序儀目前已在全球銷售超過 20,000 台 NGS 系統，因此得到更廣泛的採用。因此，使用 Illumina 平台的一個優勢是眾多已發布的協議，以及在全球研究社區中的更多知識和支持。“我們的客戶可以訪問和參與最大的應用程序、協議、圖書館準備、分析選項和技術用戶生態系統，以推動基因組研究，”墨菲說。

賽默飛世爾科技

Thermo Fisher Scientific 的 Ion Torrent 測序平台通過在測序運行期間測量半導體芯片上數百萬個孔的 pH 變化來執行 NGS，讀取輸出取決於 Ion 芯片。讀取長度取決於所使用的 Ion Torrent 系統：Ion Torrent Genexus 集成測序儀能夠產生高達 400 bp 的讀取長度，而 Ion GeneStudio S5 系統可以產生高達 600 bp 的讀取長度。

Ion Torrent Genexus 集成測序儀的運行時間從 14 到 24 小時不等（從核酸輸入到報告），並產生 15 到 6000 萬個讀數，具體取決於分析類型和样品批量大小。根據賽默飛世爾科技臨床測序部產品管理副總監 Andrew Hutchison 的說法，Ion GeneStudio S5 系統的運行時間從 3 到 24 小時不等，根據芯片的不同產生 2 到 1.3 億個讀數。

MGI/完整基因組學

MGI 是 NGS 和自動化產品的全球供應商，提供的短讀長測序產品最近變得更加商業化。他們使用 DNA 納米球測序，其中 gDNA 或 cDNA 樣本的片段通過滾環複製被擴增成 DNA 納米球，然後以高密度排列進行測序。

MGI 平台的單次讀取的最大讀取長度為 SE400，配對讀取的最大讀取長度為 PE300。儘管運行時間更長，但高密度陣列每次運行會產生許多讀取。“PE150 的典型運行時間在 3 天內，而最新型號的 G99 在 12 小時內運行 PE150，”Complete Genomics（MGI 的一部分）西海岸地區銷售總監 David Daly 指出。根據測序儀型號，每次運行的吞吐量約為 500 萬到 3600 億次讀取。

單分子測序

作為所謂的第三代測序，單分子技術較新，但隨著研究人員對它們的熟悉程度越來越高以及成本的下降，單分子技術正在普及。除了對較長的 DNA 分子進行測序外，單分子或長讀長測序還具有其他優勢，包括區分大的結構變異、高同源性或重複區域以及剪接變異的能力。單分子測序還可以在常規測序運行期間檢測 DNA 甲基化等修飾（短讀長 NGS 需要為甲基化檢測準備特殊的文庫），這對於研究表觀遺傳學很有價值。過去的缺點包括準確性較低，但該領域最近和持續的進步正在降低錯誤率（例如，準確性現在可以超過 99.9%，可與短讀平台相媲美）。

太平洋生物

PacBio 的單分子實時 (SMRT) 技術使用熒光標記的鹼基對固定在微小微孔底部的單個 DNA 分子進行測序。PacBio 的 HiFi 測序使用循環共有測序，準確率達到 99.9%，即使在基因組難以測序的區域也能提供長讀長。

讀長“取決於文庫插入片段大小，但通常為 15 kb，典型的最大讀長約為 40 kb，”PacBio 產品營銷總監 Aaron Wenger 說。在 PacBio Sequel IIe 系統上，運行時間為 30 小時，讀取次數取決於文庫。“讀取計數因文庫類型而異：全基因組測序為 200 萬，MAS-Seq RNA 測序文庫為 4000 萬，”他說。

牛津納米孔技術

Oxford Nanopore Technologies 的測序技術圍繞著讓單鏈 DNA 穿過蛋白質納米孔。由於孔的離子電導率根據其中的核苷酸而變化，因此可以通過移動通過孔的離子電流讀取 DNA 序列。“Oxford Nanopore 的平台可以對任何長度的 DNA 或 RNA 片段進行測序，從 30 個鹼基片段到全長轉錄本或數百萬個鹼基片段，以便輕鬆完整地組裝端粒到端粒的基因組，”Rosemary Sinclair 說Dokos，牛津納米孔技術公司產品管理高級副總裁。因為它可以訪問所有基因組——在一次設備運行中測序多達 14 Tb——Oxford Nanopore 測序的準確性可以超過用於捕獲結構變異或拷貝數變異的短讀長平台。

Oxford Nanopore 的平台沒有固定的運行時間；相反，“設備的運行時間與解決問題或生成所需數據所需的時間一樣短，”Sinclair Dokos 說。除了超高通量形式外，Oxford Nanopore 的平台還提供便攜式手持儀器，以支持更廣泛應用中的測序。“設備可以在傳統實驗室環境之外使用——對樣本進行分析，”她說。

其他注意事項

總體而言，NGS 供應商繼續致力於降低成本、提高可訪問性和可擴展性，目標是讓 NGS 更易於用於更多實驗室和應用。

費用

由於可用時間更長，短讀長測序更普遍且通常更便宜（儘管單分子測序成本變得更具競爭力）。延續過去幾年的趨勢，NGS 的成本繼續下降。“在將 NovaSeq 6000 與我們的第一個平台進行比較時，Illumina 致力於降低測序成本，自我們的第一個平台以來，測序成本已降低了 500 多倍，”Murphy 說。“NovaSeq 6000 的每 Gb 價格低於 5 美元/Gb。新推出的 NovaSeq X 低於 2 美元/Gb，與我們的第一個平台相比，價格降低了 1500 倍。” 無論使用何種測序平台，成本在很大程度上取決於單個項目、每個樣本的讀取次數和 NGS 使用情況。

易用性和可擴展性

與旨在最大化吞吐量的早期測序儀相比，一些較新的型號強調易用性和可擴展性。例如，為了支持小型實驗室和醫院使用內部 NGS，Thermo Fisher 提供了 Genexus 系統來自動化整個 NGS 工作流程，從樣品提取到報告，只需 20 分鐘的動手時間。Genexus 系統包括用於提取和定量核酸的 Genexus 純化系統，以及在一天內自動化文庫製備、測序和分析的 Genexus 集成測序儀。“Genexus 系統為新進入 NGS 的實驗室提供了一種簡單、快速、可擴展的解決方案，以使 NGS 內部具有成本效益，”Hutchison 說。

文章作者-Caitlin Smith

Caitlin Smith 擁有里德學院的生物學學士學位和博士學位。在耶魯大學獲得神經科學博士學位，並在 Vollum 研究所完成博士後工作。