多組學分析中的流式細胞術
所有類型的流式細胞術(傳統流式細胞術、光譜流式細胞術和質譜流式細胞術)的創新正在推動其在多組學(基因組學、轉錄組學和蛋白質組學)研究中用於分選、收集和分析細胞。Biocompare 最近舉辦了一次Bench Tips 網絡研討會 ,積極參與使用細胞術的科學家討論了他們如何利用技術進步進行各種研究應用。他們分享了與樣品製備、實驗設置和數據分析相關的經驗和最佳實踐,以幫助獲得準確和可重複的結果。以下是網絡研討會的一些重要知識。
流式細胞術是一種用於分類和分析給定細胞群中細胞數量和類型的技術。傳統的流式細胞術使用在窄光譜中捕獲的熒光標記細胞,而全光譜流式細胞術,顧名思義,捕獲整個光譜中發出的熒光,並提供有關細胞群的更多信息。
使用哪種細胞計數技術?
隨著不斷改進和新的細胞分選選項,問題始終是使用哪種儀器?答案通常歸結為生物學問題和預算限制。然而,研究人員總是很想知道他們的選擇將如何影響實驗的設計和運行,以及所獲得數據的質量和完整性。傳統和光譜細胞儀之間的區別在於如何從熒光團中捕獲發射。對於整個光譜中的所有熒光團,光譜細胞術不僅僅是查看峰值發射,而是捕獲來自所有激光器的發射。因此,獲得的信息更加全面和完整。這也允許分離具有相似發射曲線的熒光團,這是傳統細胞儀無法做到的。
質譜流式細胞儀是下一代流式細胞儀。它是飛行時間質譜 (TOF-MS) 的改編版,其中重金屬標記的抗體用於標記單個細胞上的蛋白質。金屬標記的顆粒越重,飛行時間和洗脫時間越長。質量和傳統流式細胞儀在實驗運行方式方面具有相同的工作流程。然而,質譜流式細胞術沒有光譜重疊,因為它使用金屬標籤而不是熒光團,並且數據採集時間要慢得多。
Laura Ferrer Font 博士是 Malaghan 醫學研究所的高級科學家和高維光譜細胞儀專家,他進行了一項 研究,看看是否可以使用全光譜細胞儀與質譜細胞儀識別相同的細胞群。使用 UMAP 算法的發現顯示了兩種技術的相似數據圖,這意味著正在識別相同的細胞群。結果驗證了使用不同的算法可以得到相同的結果,這使團隊相信光譜流和質譜流式細胞術都會產生相似的結果。
流式細胞儀的四大支柱
無論使用何種技術,樣品製備、面板設計、面板優化和數據分析對於任何流式細胞術實驗都至關重要。
樣品製備
樣品製備首先要有高質量的單細胞懸液,這是任何細胞分選或單細胞測序實驗的先決條件。優化消化方案和試劑非常重要。“細胞的消化很重要,因為它會影響細胞數量、細胞活力和細胞完整性,”Ferrer Font 解釋說。“如果你有很多碎片或者很多細胞已經死亡,那麼結果將是不可靠的。”
面板設計與優化
面板設計和將正確的熒光團分配給正確的標記是流式細胞術的下一個重要步驟。“設計高維全光譜流式細胞儀面板可能會讓人不知所措,”Ferrer Font 指出。“在紙上設計面板很容易,但有時相同的設計在細胞儀中不起作用。” 面板設計包括了解細胞生物學、了解儀器和光譜特徵,以及為每個標記分配正確的熒光團。在她的演講中,她分享了一些關於如何設計和優化全光譜流式細胞儀面板的提示和技巧,並概述了從在紙上製作一組標記到獲得準備好的數據所需的所有步驟 -用於分析算法。(面板設計和優化也包含在 2020 年的論文中由費雷爾字體創作。)
“按照優化設計規則設計面板後,使用真實樣本優化面板非常重要,”Ferrer-Font 補充道。(網絡研討會中共享的光譜細胞儀面板優化指南也可以在2021 年的這篇論文中找到。)面板優化涉及滴定抗體,以及評估參考對照、標記分辨率和數據質量。
抗體組設計和金屬標籤的選擇對於決定大規模細胞術實驗的成功也很重要。明尼蘇達大學醫學系 Zohar Sachs 博士實驗室研究助理 Marie Lue Antony 博士使用大規模細胞儀測量多種標記物的同時表達,以識別急性髓性白血病幹細胞中的信號通路.
“在擴展面板方面,傳統的細胞術受到光譜重疊和選擇熒光珠問題的限制,”Antony 解釋說。“使用質譜流式細胞儀,沒有光譜重疊或信號強度損失,我們使用一組標記物,可以分析單個細胞的 40 種不同參數。” Antony 補充說,了解金屬標籤和基質的性質也非常重要。金屬離子標籤有時含有一些低水平的雜質,在電離時會導致溢出和與氧化態相關的錯誤,這在使用大量標記物時通常會遇到。在網絡研討會期間,
根據安東尼的說法,質量標籤條形碼是同時分析多個樣本的下一步。“它有助於在您的實驗中添加重複,同時分析多個樣品,最大限度地減少抗體的使用量,限制技術可變性,在細胞數量有限時提供幫助,並減少儀器測量時間。” 大規模流式細胞術的主要挑戰是樣品的破壞,這會阻止其用於其他下游分析。“與傳統流式細胞儀每秒 50,000 個細胞相比,它每秒 200-1000 個細胞的通量也相對較慢。”
數據分析
“當你計劃你的實驗時,數據分析真的從一開始就開始了,”細胞和發育生物學系 Jonathan Irish 博士和 Rebecca Ihrie 博士實驗室研究員 Todd Bartkowiak 博士解釋說在范德比爾特大學。在網絡研討會中,他討論了規劃和進行大規模細胞術實驗的挑戰、如何規劃數據收集以及獲取數據後的操作。“重要的是要考慮實驗需要做什麼——無論是縱向分析還是比較治療和結果。您必須考慮樣本量,以及是否有足夠的能力進行統計比較。你有適當的控制,你有足夠的樣本來驗證嗎?”
在查看高維數據集時,手動門控協議可能非常耗費人力並且容易出錯。高維算法可以在多個時間點查看多個參數和標記,節省時間並提高準確性。有不同類型的多維分析管道用於降維、聚類和高級機器學習。
使用 t-SNE(t 分佈隨機鄰域嵌入)或 UMAP(統一流形逼近和投影)的降維用於數據可視化。多種聚類算法,如 SPADE、留聲機或 FlowSOM,可用於根據某些相似性對數據進行分組。機器學習是一種通過降維和聚類將復雜數據提煉成知識的方法。“柑橘可用於將細胞豐度與結果相關聯,”Bartkowiak 指出。“標記富集模型可識別樣品中的不同細胞群。這對於您不知道會發生什麼的表型非常有用。RAPID(風險評估人口識別)將人口豐度與結果相關聯。”
Bartkowiak 補充說:“始終進行試點實驗以通過您的數據分析管道。” “通過採用高維數據分析管道和統計方法來驗證研究結果非常重要。你應該進行手動門控、重複分析、正交管道、隨機化或丟棄數據,最後留出一個驗證隊列來重複一些實驗。”
流式細胞儀的下一步是什麼?
Daniel Schraivogel 博士是歐洲分子生物學實驗室 (EMBL) 基因組生物學部門的研究人員,最近 在《科學》雜誌上發表了一篇論文,描述了一種新型、高速、支持圖像的流式細胞儀細胞分選技術,結合使用多色熒光顯微鏡,根據空間圖像衍生數據做出高速分揀決策。
“將顯微鏡和細胞分選相結合是一項艱鉅的任務,因為它涉及快速流動細胞的無模糊成像,以及實時圖像重建和分析,”Schraivogel 說。他的工作描述了將傳統的流式細胞儀與 BD CellView 圖像技術相結合,以在微秒時間範圍內獲得細胞圖像。“它易於使用,適用於所有可以用傳統分選儀分析的細胞類型,並且兼容所有類型的熒光標記。”
傳統的流式細胞儀無法在有絲分裂期間對細胞進行分類。在網絡研討會期間,Schraivogel 談到了圖像支持的細胞分選現在如何應用於功能基因組學,以在數小時(而不是數周和數月)內執行基於全基因組成像的篩選,以及如何使用它來識別和分離細胞在不同的有絲分裂階段。使用這種技術在較低的分辨率和分類方面存在一些限制,這取決於其相對於成像平面的方向。分析、集成和存儲成像數據也可能具有挑戰性。但它開闢了巨大的可能性,這可能會進一步推動細胞術的發展和使用。
文章作者-Tanuja Koppal
Tanuja Koppal 博士是一位科學作家、分析師、顧問和 Biomics Consulting 總裁。她擅長發現生命科學領域的新興趨勢,在過去 14 年中撰寫了多篇文章,主持了針對全球科學界的網絡研討會,並組織了 100 多個與藥物發現和開發相關的會議。在開始她的諮詢生涯之前,她是 Reed Business Information 的藥物發現和開發、基因組學和蛋白質組學以及 PharmaAsia 的主編。她在肯塔基大學完成了博士工作,並在西北大學醫學院完成了博士後研究,專注於了解導致阿爾茨海默病神經退行性變的細胞通路。