蛋白質組學樣品製備的技巧和竅門
蛋白質組學的樣品製備涉及平衡分析物回收率與目標的穩定性和分析平台的要求,這通常是高效液相色譜 (HPLC),然後是質譜。
為了幫助管理這種平衡行為,Cytiva 的全球產品經理 Emma Lind 提供了以下一般提示:
- 使用盡可能溫和的程序,避免劇烈的組織破壞
- 在低於環境溫度下快速執行隔離步驟
- 使用可保持 pH/離子強度並穩定樣品的緩衝液
- 添加蛋白酶抑製劑和/或淬滅劑以保護分析物免受正在進行的代謝過程
細胞裂解
對於細菌培養,超聲處理是從兩升或更少的細胞培養物中破壞細胞壁的最常用方法。“這裡的主要挑戰是通過將細胞懸浮液保持在冰上並以 5 到 10 秒的短脈衝進行超聲處理來控制溫度,暫停 10 到 30 秒,”林德說。均質器也可以工作,但必須注意避免高溫和起泡,這會使蛋白質失活。酶促裂解可消化細菌細胞壁的肽聚醣層,它適用於許多細菌物種,但革蘭氏陰性菌(例如大腸桿菌)需要去污劑才能完全透化其肽聚醣層。
“在裂解過程中會釋放出大量 DNA,這使得製劑變得粘稠。DNase 可以消化 DNA,但對於大型製備來說可能會變得昂貴,”Lind 補充道。“在這種情況下,你可能會考慮超聲處理。”
均質化也適用於酵母,但均質器必須在比細菌製備更高的壓力下運行。玻璃珠渦旋也廣泛用於酵母,特別是對於高達 15 mL 的體積。為避免過熱,Lind 建議在幾個循環中攪拌電池 30 到 60 秒,在攪拌之間進行冷卻。
“酵母細胞的酶解是基於酶對細胞壁的消化,其中 Zymolyase™ 和裂解酶是最廣泛使用的試劑,”Lind 補充道。“這適用於任何規模,但如前所述,大規模的準備工作可能會變得昂貴。”
昆蟲細胞缺乏細胞壁,因此它們會迅速裂解。最常見的破碎方法是使用組織研磨機(例如 Dounce 均質機)使用低濃度去污劑。“如果您的細胞懸液體積大於 25 mL,請考慮使用電動勻漿器,”Lind 說。“或者,含有溫和非離子洗滌劑的商業蛋白質提取試劑盒適用於小體積。”
對於哺乳動物細胞和分泌蛋白,離心或過濾產生適合第一個色譜步驟的澄清樣品。然而,當目標蛋白在細胞內表達時,Lind 建議使用勻漿器(例如,French press)進行裂解。“或者,您可以使用商業蛋白質提取試劑盒進行少量細胞懸液。”
DNA/RNA 去除和澄清
必須去除裂解過程中釋放的核酸以避免高粘度和/或乾擾後續色譜步驟。方法包括在冰上用 DNase 酶消化 10 到 15 分鐘,在超聲處理期間進行機械剪切(如果使用法國壓榨機,則添加 DNase),或用聚乙烯亞胺或硫酸魚精蛋白沉澱,然後離心。
Lind 建議使用標準離心或過濾來澄清樣品。“為確保它們透明且不含顆粒,請在將樣品加入色譜柱之前立即將樣品通過 0.22 µm 或 0.45 µm 過濾器和/或離心機。”
離心應始終在冷態下進行。對於細胞裂解物,以 40,000 至 50,000 × g 離心 30 分鐘,如果需要,可縮短至 10 至 15 分鐘。對於小樣品量,以可用的最高 g 力離心,例如在台式離心機中以 15,000 × g 離心 15 分鐘。
“過濾比離心耗時少,您通常可以使用注射器過濾器處理相對較大的體積,高達 50 到 100 mL,”Lind 告訴 Biocompare。“使用蛋白質結合率低的注射器過濾器,例如再生纖維素、PES、PVDF 或醋酸纖維素。
針頭和乾草堆
典型樣品中表達的蛋白質數量之多、蛋白質組的巨大濃度動態範圍(七到八個數量級)以及各種細胞和組織之間的表達水平差異會混淆蛋白質組學樣品的製備。
賽默飛世爾蛋白質組學和轉化研究總監 Daniel Lopez-Ferrer 博士表示,血漿是許多蛋白質組學工作流程的起始材料,其中包含數千種蛋白質,但少數高豐度物種佔質量的 99%科學的。“一些蛋白質在一種細胞類型中表達,但不是在另一種細胞類型中表達。例如,皮膚表達結構蛋白,而心臟組織表達與心臟功能相關的蛋白質。”
準備過程中的步驟越多,出錯的機會就越大,尤其是在手動工作流程中,時間差異和技術可變性的影響是複雜的。Lopez-Ferrer 說:“你可能直到很久以後才會注意到後果,尤其是當實驗依賴於 LC-MS 時。” 例如,鹽或去污劑的不完全去除會干擾檢測階段。“蛋白質組學樣品製備是一個難題,所有部分都必須完美地結合在一起。”
目標富集和乾擾消除可以彌補一些不足,但使用哪種策略取決於分析物和基質。請注意,只要樣品完全溶解,這些過程很容易通過移液或液體處理機器人實現自動化。
傳統的增溶方法包括使用尿素、去污劑和有機溶劑,它們各有優缺點。這些試劑應選擇不會對蛋白質產生不利影響、易於去除且與 LC-MS 兼容的試劑。蛋白質組學樣品製備試劑盒,如 Thermo Scientific EasyPep™ MS 樣品製備試劑盒,通過提供所有試劑和標準方案降低了複雜性。“我們試圖提供一種通用的化學方法,可以從大量樣品中提取蛋白質,”Lopez-Ferrer 解釋說。“結果是一致的,因為過程是一致的,LC-MS 分析的輸入也是一致的。”
工業化
重新利用生物分析以支持醫學診斷,特別是個性化醫療的壓力很大,但也存在嚴峻的挑戰。
“雖然我不會很快看到連鎖藥店安裝 MS 儀器,但我認為我們最終會實現這一目標,”Lopez-Ferrer 說。“一篇 2021 年的論文來自 Akhilesh Pandey 教授的演示展示了臨床實驗室如何在診斷分析中使用我們的儀器。挑戰將在於方法標準化和擴大這些檢測的能力。我們實際上非常接近這個想法,因為我們已經展示了數百個樣品的快速、自動化、同時製備。但是,關於如何將樣本進出分析平台,以及如何存儲、檢索和從它們生成的大量數據中學習,我們還有很多東西要學習。此外,在某些情況下,更簡單的分析就足夠了。
文章作者-Angelo DePalma
Angelo DePalma 獲得了博士學位。石溪大學有機化學博士,曾任先靈葆雅高級科學家。他撰寫了大量關於生物技術、生物製造、醫療設備、醫藥商業、實驗室儀器和先進材料的文章。