選擇 PCR 方法的指南
PCR 已經改變了生物學研究,隨著科學家們為追求自己的研究目標而採用這種方法,它的廣泛使用促進了 PCR 品種的發展。“PCR 檢測的簡單性和靈活性使其可用於各種應用,”賽默飛世爾科技基因檢測解決方案研發副總裁 Kamini Varma 說。“例如,在癌症研究中,研究人員可能想知道一組基因的表達水平如何隨著細胞發育、疾病進展階段或對治療劑的反應而變化。” 與臨床研究一樣,PCR 在所有應用中都至關重要。“常規 PCR、qPCR 和多重 PCR 在日常研究中繼續無處不在,”NEB DNA 擴增產品營銷經理 Steven Chiu 補充道。“在所有方法中,研究人員正在尋找能夠提供簡單性和性能的產品。” 本文回顧了最常見的 PCR 方法,以及它們的優點和應用。
常規/終點 PCR
常規 PCR 提供終點結果,並且相對便宜且直接使用熱循環儀進行,然後進行凝膠電泳以進行序列檢測。在檢測樣品中是否存在 DNA 序列(例如基因分型、菌落篩選)時,常規 PCR 是最好的。“當您想要確認樣本中存在或不存在靶標時,端點 PCR [很有用”,Promega PCR 技術產品經理 Adam Waite 說。“通過一些端點設置,您可以在幾分鐘內得到是/否的答案。”
定量 PCR
定量 PCR (qPCR),也稱為實時 PCR,在兩個重要方面與傳統 PCR 不同:qPCR 允許您量化起始材料的量,並且可以使用熒光探針(例如, TaqMan 探針)或熒光嵌入染料(例如,SYBR Green)。在 qPCR 中,實時熱循環儀記錄每個 PCR 循環期間的熒光信號。“由於僅在熒光探針降解時才會產生信號,因此基於 TaqMan 的 qPCR 測定提供了非常高的序列特異性,”賽默飛世爾科技遺傳科學產品應用副總監 Stephen Jackson 說。“這使其成為大多數轉化研究、臨床研究和其他需要高靈敏度和特異性的研究的首選方法。”
有時在 qPCR 之前使用逆轉錄 (RT) 將逆轉錄病毒的 RNA 翻譯成 cDNA,作為 qPCR 的起始材料,這一過程稱為 RT-qPCR。RT-qPCR 的靈敏度和可靠性很快使其成為冠狀病毒檢測的金標準。“近年來,定量 PCR 大力推動取代終點作為 PCR 技術的黃金標準,”Waite 說。“實時測量樣本產量和多重目標的能力使其成為靶向疾病跟踪和控制的關鍵策略。”
在當今的許多研究領域,qPCR 用於測量基因表達水平和確定基因型。“在遺傳性疾病、藥物基因組學、作物科學、環境監測、了解正常表型變異和檢測基因組中的表觀遺傳變化方面,使用基於 TaqMan 的 qPCR 測定來確定基因型,”Varma 說。
多重PCR
多重 PCR 使用多組引物,允許研究人員在同一 PCR 反應(常規或定量 PCR)中同時詢問多個目標。“多重 PCR 通過在單個反應中檢測多個目標來減少所需的樣品量,從而提高通量並節省時間,”Chiu 說。“與運行多個獨立的 PCR 實驗相比,這是一種從單個測試運行中獲得更多信息的經濟有效的方法。”
多路復用可能是有利的,因為它可以節省時間和試劑,但需要提前計劃以盡量減少引物的非特異性結合和交叉反應,並協調不同引物的熔解溫度。“基於 TaqMan 的 qPCR 檢測可用於多重目標檢測,因為不同的熒光染料可以與不同的探針偶聯,”Jackson 說。“因此,單個 PCR 反應可以根據染料的選擇和儀器的能力為不同的目標生成豐度測量值。” 多路復用幾乎可以應用於任何 PCR 分析,以提高通量並減少所需的樣本量。例如,多重 qPCR 的基因分型可用於識別單個樣本中存在的病毒或細菌菌株。
數字和數字微滴 PCR
數字 PCR 或數字微滴 PCR(dPCR 或 ddPCR)依賴於將 DNA 樣本分成許多隔間的原理,這樣每個隔間最有可能包含一個序列(大多數隔間將包含一個,而有些將包含零個或兩個,很少三個)。因為序列以二元方式分佈在隔間中,所以可以使用泊松分佈來分析隔間中是否存在 DNA。該分析提供了對原始 DNA 樣品中起始材料量的估計。
數字 PCR 不僅高度敏感和可靠,而且受 PCR 抑製劑和密切相關序列存在的影響也較小。“當您需要解決抑制問題、尋找稀有靶標或變體,並希望獲得 qPCR 無法提供的非常精確的測量結果時,數字 PCR 是一個很好的工具,”Waite 解釋道。
雖然不如其他 PCR 方法常見,但 dPCR 越來越多地用於依賴稀有或複雜樣本的應用中。“臨床研究人員可能希望檢測一種罕見的癌性等位基因或使用液體活檢監測殘留疾病,”Varma 說。“數字 PCR 方法通常用於這些分析,因為它們在混合基因型樣本中具有精確性和敏感性。”
數字微流體技術的進步可能使更多研究人員可以使用 dPCR,並可以提高所有類型 PCR 的易用性和通量。“PCR 實現的應用類型實際上只受研究人員想像力的限制,”Varma 說。